模擬失重致人臍靜脈內皮細胞異常和紅花甙修復效應的實驗研究.pdf

1、航天失重環(huán)境可導致機體心血管系統(tǒng)由于重力的消失產生異常，即使宇航員暴露于失重環(huán)境的時間十分短暫，心血管系統(tǒng)也會產生一系列適應性變化，并將直接影響宇航員身體健康，嚴重時會威脅飛行安全。這些由于失重誘發(fā)的心血管系統(tǒng)適應性改變的綜合癥被稱作心血管失調（Cardiovasculardeconditioning,CD），表現(xiàn)以立位不耐受，心悸，暈厥為主，然而目前關于CD產生機制的闡釋仍遠遠不夠明確。內皮細胞不僅是血液與血管組織之間天然的解剖屏障，

2、而且是血管活性器官。血管內皮細胞不僅具有選擇通透性、抗血栓、調節(jié)血管緊張度、促進毛細血管形成以及產生血細胞粘接因子等功能，而且還是多種血管活性物質、細胞因子以及生長因子的來源和靶器官，血管內皮細胞的損傷與多種心血管功能失調有密切的關系。
　　近年來，地面模擬研究證實-6°頭低位臥床受試者血液中可檢測到凋亡的內皮細胞；同時，另有學者在尾部懸吊后肢卸荷模型大鼠的血管組織中檢測到高表達的誘導型一氧化氮合成酶（inducednitrico

3、xidesynthase,iNOS），提示模擬失重可導致內皮細胞可產生多種異常。本研究采用地面二維回轉培養(yǎng)器（2D-clinostat）模擬細胞在空間中的受力狀態(tài)，以地面正常1g重力（Normalgravity,NG）作對照，對模擬微重力（Modeledmicrogravity,MMG）干預后人臍靜脈內皮細胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVECs）的形態(tài)與功能進行多角度評價，為明確內皮細胞損

4、傷可能是介導CD產生的重要機制提供數(shù)據(jù)支持。大量臨床與實驗室研究提示：活血化瘀類中藥對血管內皮細胞有明確的保護作用并能通過調節(jié)其分泌血管活性物質調節(jié)血管功能。研究表明，紅花甙（Carthamin）可抑制內皮細胞損傷并改善內皮細胞功能。因此，本研究在明確MMG導致內皮細胞損傷的基礎上，將進一步采用Carthamin對MMG作用下HUVECs進行干預，觀察其逆轉與修復效應，為失重致CD的藥物防護治療提供實驗依據(jù)。
　　實驗一MMG導致

5、HUVECs細胞骨架重構及其對細胞增殖、遷移的影響
　　目的：觀察MMG致HUVECs細胞骨架結構（纖維狀肌動蛋白和微管）的改變，并對MMG作用后細胞的增殖、遷移等功能進行評價。
　　方法：酶消化法原代培養(yǎng)HUVECs，流式細胞術（FCM）進行鑒定，取3～5代的HUVECs進行實驗，隨機分為2D-clinostat干預的MMG培養(yǎng)組與NG對照培養(yǎng)組，均培養(yǎng)48h；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)及流式細胞術分析細胞增殖、凋

6、亡及細胞周期變化；Transwell觀察細胞遷移情況；免疫熒光及激光共聚焦觀察HUVECs細胞骨架結構。
　　結果：①HUVECs的培養(yǎng)與鑒定：所培養(yǎng)的HUVECs細胞經流式細胞術鑒定，其CD31與Ⅷ因子為表達較高。②HUVECs骨架觀察結果：NG對照組的纖維狀肌動蛋白（fibersactin,f-actin）為束狀、放射狀，其方向感明顯，且呈現(xiàn)出具有較多偽足的纖維骨架結構；然而MMG作用48h后，盡管f-actin沒有發(fā)生明顯的

7、崩解但是其方向感明顯消失，并且f-actin的束狀纖維也大部分消失；MMG干預48h使大量的微管蛋白發(fā)生解聚，微管的網狀結構已經模糊不見，隨之代替的是崩解的微管小聚體。③細胞增殖及凋亡檢測：MMG可使HUVECs增殖明顯抑制，細胞周期抑制于G2/M期（G2/M：MMG,27.6％，NG,18.1％；P＜0.05），然而細胞并沒有發(fā)生明顯凋亡。④細胞遷移檢測：MMG干預可使HUVECs的遷移受到抑制，抑制率為-62.7％(P＜0.05)。

8、
　　結論：MMG可顯著影響HUVECs的形態(tài)與細胞骨架結構并抑制其增殖與遷移功能，HUVECs的增殖抑制可能與紊亂的微管結構密切相關。
　　實驗二MMG對HUVECs的FAs形成、定位以及FAs功能的影響
　　目的：對MMG干預下HUVECs的FAs多種參數(shù)進行半定量觀測，并對FAs的酪氨酸活化水平進行評價，進一步檢測其中關鍵蛋白激酶和FAs中酪氨酸激酶的主要受體integrins的表達。
　　方法：激光共聚焦

9、結合高通量激光半定量計算方法，對FAs的各項參數(shù)進行評價，其參數(shù)包括FAs平均數(shù)量(meanvinculinspotnumberpercell,VN)；FAs平均面積(meanvinculinspotarea,VA)；FAs平均交疊面積(theareapercentageofoverlapofFAs,OSP)；FAs平均到細胞邊緣距離(averagedistanceofvinculinspotsfromthecelledge,DS）。免

10、疫熒光觀察酪氨酸磷酸化（Tyrosinephosphorylation,PTyr）水平，Westernblot檢測FAK，pyk2，ILK的總表達量與磷酸化表達量，Westernblot以及RT-PCR檢測integrinβ1和β4的表達。
　　結果：①FAs形態(tài)學改變：FAs在MMG干預下，形成的數(shù)量（VN）與面積（VA）明顯減少，VN較NG對照組減少-50.6％(P＜0.05)，VA較NG對照組減少-60.2％(P＜0.05)

11、，F(xiàn)As定位指標DS也不同于NG對照組-28.3％(P＜0.05)。②PTyr水平檢測：MMG干預后，F(xiàn)As的PTyr活化水平明顯抑制(-71.3％)(P＜0.01)。③FAs激酶活性：MMG影響后FAK，pyk2，ILK總蛋白表達沒有明顯改變，然而其磷酸化水平明顯下調，F(xiàn)AK，pyk2，ILK下調量分別為：-27.2％，-30.8％，-36.5％(P＜0.05)。④integrins結果：MMG可導致integrinβ1和β4在mRN

12、A與蛋白水平表達下調。
　　結論：MMG可影響HUVECs的FAs的生成以及定位，并且其與integrins相關的酪氨酸活化功能及核心激酶磷酸化水平也明顯下調。
　　實驗三Carthamin干預MMG條件下HUVECs形態(tài)和功能的實驗研究
　　目的：觀察Carthamin對MMG作用后HUVECs的增殖、遷移以及細胞骨架的影響。
　　方法：MMT摸索Carthamin作用最佳濃度，2D-clinostat進行失重

13、模擬培養(yǎng)HUVECs，實行分組如下：NG對照組，MMG對照組，Carthamin+MMG組。采用細胞計數(shù)、流式細胞術檢測各組細胞增殖，Transwell檢測細胞遷移；觀察Carthamin干預后細胞骨架蛋白的改變情況。
　　結果：①給藥濃度：Carthamin的最佳給藥濃度為10μg/ml。②細胞增殖檢測：MMG可使HUVECs增殖明顯抑制，然而Carthamin的干預并沒有逆轉MMG導致HUVECs細胞增殖抑制的情況。③細胞遷移

14、檢測：Carthaminl孵育48h后，MMG組的遷移情況明顯改善，MMG+Carthamin組較MMG對照組遷移細胞數(shù)增加了38％（P＜0.05）。④細胞骨架結果：Carthamin干預后，盡管彌散情況沒有明顯改善，但我們可觀察到細胞的偽足較MMG對照組增多，微管改善不明顯，MMG+Carthamin組仍然顯示為彌散的數(shù)個微管亞聚體。
　　結論：Carthamin可明顯改善由于MMG作用而導致的HUVECs細胞遷移抑制，并修復由

15、于MMG作用導致HUVECs細胞骨架f-actin的骨架重排現(xiàn)象。
　　實驗四基于FAs以及RhoA對Carthamin修復MMG致HUVECs遷移抑制分子機理的實驗研究
　　目的：觀察Carthamin對MMG條件下HUVECs的FAs的影響，以及基于RhoA初步探討了其在介導Carthamin修復MMG致HUVECs遷移抑制的分子機制。
　　方法：2D-clinostat進行失重模擬培養(yǎng)HUVECs，Cartham

16、in干預后檢測FAs的VA,VN及DS的變化；ExoenzymeC3Transferase抑制RhoA活性后，檢測FAs的PTyr活化情況以及下游蛋白ILK、Cofilin的磷酸化水平。
　　結果：①FAs形態(tài)學結果：Carthamin可顯著改善由于MMG導致HUVECs的FAs的形態(tài)學變化，采用10μg/ml的Carthamin干預處理后，MMG+Carthamin組的FAs的數(shù)量與面積較MMG對照組均明顯增加，其中VN增加30

17、.3％（P＜0.05），VA增加25.8％（P＜0.05）；進一步對FAs的DS進行分析，較MMG對照組MMG+Carthamin組的DS升高了36.4％。（P＜0.05）。②RhoA阻斷遷移結果：ExoenzymeC3干預RhoA活性后，Carthamin的修復效應即被阻斷，其遷移細胞數(shù)與阻斷前比下降33.3％（P＜0.05），阻斷后的HUVECs的遷移能力與MMG對照組沒有明顯差異。③RhoA阻斷PTyr以及ILK、Cofilin的