沉默NSE對(duì)SCLC細(xì)胞增殖和侵襲的影響.pdf

1、研究目的：
　　構(gòu)建特異性 siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 SCLC細(xì)胞抑制 NSE基因的表達(dá)，通過(guò)Western blot檢測(cè)NSE的抑制效果，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察NSE沉默后SCLC細(xì)胞株的存活狀況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8法檢測(cè)高表達(dá)NSE和NSE沉默的SCLC細(xì)胞周期和增殖能力的變化，利用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)高表達(dá)NSE和NSE沉默的SCLC細(xì)胞侵襲能力變化，通過(guò)Western blot檢測(cè)E-cadherin，nm23，

2、VEGF等肺癌轉(zhuǎn)移指標(biāo)的變化，為探討NSE與SCLC親腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)性與可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．SCLC細(xì)胞株篩選：通過(guò)Western blot檢測(cè)4種型號(hào)SCLC細(xì)胞株的NSE蛋白表達(dá)，選擇其中NSE蛋白表達(dá)最高的細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2. SCLC細(xì)胞NSE基因沉默：選擇NSE高表達(dá)的SCLC細(xì)胞株，利用NSE特異性的siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體啟動(dòng)RNAi機(jī)制，抑制該細(xì)胞株NSE基因表達(dá)，篩選

3、出最佳干擾效率的序列。
　　3．檢測(cè)NSE基因抑制效果及肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)變化：抑制NSE表達(dá)后，利用Western blot檢測(cè)SCLC細(xì)胞株NSE蛋白表達(dá)量變化觀察抑制效果，標(biāo)定其中干擾最強(qiáng)的序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)檢測(cè)肺癌轉(zhuǎn)移指標(biāo)E-cadherin，nm23，VEGF表達(dá)的變化。
　　4．檢測(cè)高表達(dá)NSE和NSE沉默后的SCLC細(xì)胞的存活﹑增殖與侵襲的狀況：①利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察高表達(dá) NSE的 SCLC細(xì)胞株同內(nèi)

4、源性敲低 NSE的SCLC細(xì)胞株存活情況。②CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)NSE的SCLC細(xì)胞和NSE沉默的SCLC細(xì)胞周期和生長(zhǎng)增殖能力的變化。③利用Transwell小室檢測(cè)高表達(dá)NSE和NSE沉默的SCLC細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　5．?dāng)?shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果均值用x+s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，＊p<0.05和＊＊p<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPS

5、S16.0軟件分析和處理，以及Graphpad Prism5輔助分析以及制作圖形。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1．細(xì)胞株的選擇：在4組SCLC細(xì)胞株NSE蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中，選擇NSE蛋白表達(dá)最高的NCI-H209為本次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。
　　2．SCLC細(xì)胞NSE基因沉默：構(gòu)建特異性siRNA質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染SCLC細(xì)胞啟動(dòng)RNAi機(jī)制，抑制NSE基因表達(dá)。為獲得持續(xù)穩(wěn)定抑制NSE表達(dá)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，采用上海吉瑪制藥技

6、術(shù)有限公司提供的基因序列合成的NSE特異性siRNA質(zhì)粒載體，分別命為：NSE-SiRNA-1,NSE-SiRNA-2,NSE-SiRNA-NC，并轉(zhuǎn)染NCI-H209細(xì)胞株。
　　3．Western blot檢測(cè)質(zhì)粒載體干擾NSE基因和肺癌轉(zhuǎn)移指標(biāo)結(jié)果：轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1和NSE-SiRNA-2與NSE-SiRNA-NC相比，其NSE蛋白表達(dá)量明顯下降。表示NSE-SiRNA-1和NSE-SiRNA-2已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染入NC

7、I-H209細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1或NSE-SiRNA-2能夠明顯抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NSE基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-NC的NCI-H209細(xì)胞株的NSE蛋白表達(dá)量變化不明顯。本研究挑選了抑制效果最好的NSE-SiRNA-1序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，檢測(cè)肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)中發(fā)現(xiàn)E-cadherin、nm23表達(dá)升高，而VEGF表達(dá)降低。
　　4．高表達(dá)NSE和NSE沉默的NCI-H209細(xì)胞株的存活與增殖狀況：①克隆

8、形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NCI-H209細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1和轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-NC，培養(yǎng)2周后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色觀察所形成的克隆，通過(guò)觀察可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-NC的細(xì)胞，不僅形成的細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少，而且克隆分子大小也明顯減小(＊P<0.05)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1對(duì)SCLC細(xì)胞的克隆形成能力有明顯的抑制作用。②CCK-8主要是檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示：

9、以NSE-SiRNA-NC組的細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染了NSE-SiRNA-1的
　　NCI-H209細(xì)胞株，細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-NC的細(xì)胞增殖能力明顯抑制。③流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-NC在48h后，SCLC細(xì)胞處于G1、S、G2/M周期的細(xì)胞比例分別為(63％±3.0％)、(26%±4.0%)、(11%±4.0%)，而轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1組的細(xì)胞處于G1、S、G2/M周期的細(xì)胞比例分別為(

10、67.0％±2.0％)、(15.0%±2.0%)、(18.0%±2.0%)。說(shuō)明抑制NSE基因表達(dá)導(dǎo)致SCLC細(xì)胞周期中S期細(xì)胞百分率顯著降低。
　　5．Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了NSE-SiRNA-NC的NCI-H209細(xì)胞穿膜能力較強(qiáng)，穿膜細(xì)胞數(shù)約為200，而轉(zhuǎn)染NSE-SiRNA-1的NCI-H209細(xì)胞穿膜能力較弱，穿膜細(xì)胞數(shù)較少為(90±15)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.轉(zhuǎn)染NSE