年齡因素對(duì)BMSCs移植治療大鼠后肢缺血的影響及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、研究目的: 探討年齡因素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)促血管新生作用的影響及其可能機(jī)制。 方法與結(jié)果: 1．年齡因素對(duì)BMSCs移植治療大鼠后肢缺血的影響分離培養(yǎng)年輕(6-8周齡)和年老Lewis(60-64周齡)大鼠的BMSCs，采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析檢測(cè)BMSCs表面抗原標(biāo)志的表達(dá)。通過結(jié)扎并切斷右側(cè)髂總動(dòng)脈、股動(dòng)脈近端及股淺動(dòng)脈遠(yuǎn)端，建立大鼠后肢缺血模型。隨機(jī)分為六組，每組10只大鼠，YY組，年輕供體BMS

2、Cs移植到年輕大鼠；OY組，年老供體BMSCs移植到年輕大鼠；YO組，年輕供體BMSCs移植到年老大鼠，OO組，年老供體BMSCs移植到年老大鼠；年輕對(duì)照組(YC組)和年老對(duì)照組(OC組)，基礎(chǔ)培養(yǎng)液(IMDM)注射到年輕及年老大鼠。術(shù)后一天，右側(cè)后肢內(nèi)收肌局部注射5×10<'6>BMSCs或等量的IMDM。于術(shù)后、移植后7、14及21天，激光多普勒血流分析儀掃描后肢，了解肢體遠(yuǎn)端血流恢復(fù)情況。于移植后21天，處死動(dòng)物后取股內(nèi)側(cè)肌制作病

3、理切片，抗vWF免疫熒光染色及抗α-SMA染色，了解毛細(xì)血管密度及小動(dòng)脈密度。獲取雙側(cè)腓腸肌，了解右側(cè)腓腸肌萎縮情況。 年輕及年老供體BMSCs均陽性表達(dá)CD29和CD90.1，部分陽性表達(dá)CD117，而CD34及CD45均呈陰性，年輕細(xì)胞的cD117表達(dá)率明顯高于年老細(xì)胞，其余細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。激光多普勒成像指數(shù)(LDPI index)定量分析顯示：術(shù)后組間無明顯差別；移植后21天，與對(duì)照組比較，各細(xì)胞移植組的

4、肢體遠(yuǎn)端血流供應(yīng)均明顯改善，且年輕供體BMSCs明顯高于年老供體BMSCs。與對(duì)照組比較，各移植組的毛細(xì)血管密度及小動(dòng)脈密度均明顯增加，年輕供體BMSCs組高于年老供體BMSCs組。與對(duì)照組比較，各移植組腓腸肌的萎縮率均顯著下降，年輕供體細(xì)胞組明顯高于年老供體細(xì)胞組。 2．年齡因素影響B(tài)MSCs促血管新生作用的可能機(jī)制 2．1離體實(shí)驗(yàn) 2．1．1缺氧缺血清環(huán)境下，年齡因素對(duì)BMSCs旁分泌(FGF-2及VEGF)

5、功能的影響 取自年老及年輕供體BMSCs隨機(jī)分為4組：年輕細(xì)胞缺氧缺血清組(YH組)，年老細(xì)胞缺氧缺血清組(0H)，年輕細(xì)胞對(duì)照組(YN組)，年老細(xì)胞對(duì)照組(ON組)，收集條件培養(yǎng)液，ELISA測(cè)定FGF-2及VEGF的蛋白水平。 結(jié)果顯示，YN組及ON組的VEGF及FGF-2水平無明顯差別，與YN組及ON組比較，YH組及OH組上述蛋白水平均有不同程度的升高，但OH組的FGF-2水平升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，YH組明顯高于OH組

6、。 2.1.2 缺氧缺血清環(huán)境下，年齡因素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 取自年老及年輕供體的BMSCs在缺氧缺血清下培養(yǎng)24小時(shí)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果顯示，年老供體BMSCs的凋亡率明顯高于年輕供體BMSCs。 2.2在體實(shí)驗(yàn) 2.2.1移植BMSCs在缺血肌肉組織中分化的測(cè)定： 將PKH26標(biāo)記BMSCs移植到缺血組織。移植后21天用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞分化情況。

7、 在熒光顯微鏡下觀察，可見少量的BMSCs呈PKH26、DAPI、vWF或α-SMA三陽性。在共聚焦顯微鏡下觀察，未見BMSCs呈PKH26、DAPI、vWF或α-SMA三陽性，2.2.2 年齡因素對(duì)移植BMSCs旁分泌和EPC動(dòng)員的影響： 細(xì)胞移植后7天，獲取外周血及脾臟，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34圾KDR雙陽性EPC數(shù)量；獲取右側(cè)內(nèi)收肌測(cè)定FGF-2及VEGF的蛋白水平。 結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，細(xì)胞移植組的外周及脾臟

8、中EPC數(shù)量顯著地增加，年輕供體BMSCs移植組明顯高于年老供體BMSCs移植組；與對(duì)照組比較，BMSCs移植組增加了缺血骨骼肌組織的VEGF和FGF-2水平，年輕供體BMSCs移植組明顯高于年老供體BMSCs移植組。 2.2.3 年齡因素對(duì)移植BMSCs在缺血肌肉組織中生存的影響： 將Brdu標(biāo)記的BMSCs移植到缺血肌肉組織中。移植后21天檢測(cè)移植局部BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果顯示：YY組的BrdU陽性BMS

9、Cs數(shù)量明顯高于OY組、YO組及OO組；與OO組比較，OY組及YO組的BMSCs數(shù)量明顯增多，OY組及YO組組間無差異。 結(jié)論 1．無論是年輕供體還是年老供體BMSCs移植均能促進(jìn)年老及年輕受體大鼠后肢缺血模型的血管新生，改善肢體遠(yuǎn)端血液供應(yīng)和減輕缺血腓腸肌的萎縮。 2．年輕供體BMSCs促進(jìn)血管新生作用明顯優(yōu)于年老供體BMSCs。 3．年齡因素影響B(tài)MSCs促血管新生的可能機(jī)制： (1)年輕供體