RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中α亞型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種由于感光細(xì)胞進(jìn)行性缺失,導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)各層神經(jīng)元發(fā)生繼發(fā)變性的嚴(yán)重致盲性疾病,近年來人們已對(duì)該病的治療進(jìn)行了各種嘗試,包括視網(wǎng)膜移植、基因治療、視覺假體、藥物干預(yù)等,取得了一定的進(jìn)展,但由于視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)病機(jī)制尚不明確,因此為了明確其發(fā)病機(jī)制,尋找有效的治療手段,我們需要對(duì)該疾病進(jìn)行深入的研究。
　　 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion ce

2、lls,RGCs)是視網(wǎng)膜內(nèi)的第三級(jí)神經(jīng)元,也是視網(wǎng)膜發(fā)育中第一個(gè)產(chǎn)生的神經(jīng)元,其樹突主要接受視網(wǎng)膜內(nèi)的第二級(jí)神經(jīng)元視錐雙極細(xì)胞(retinal bipolar cells,RBCs)的信息傳遞,同時(shí)也可通過無長突細(xì)胞橫向聯(lián)系;其軸突延伸形成視神經(jīng),是視覺傳輸系統(tǒng)的重要組成部分。RGCs的樹突是接受神經(jīng)信號(hào)傳入的主要部位,樹突的形態(tài)發(fā)生對(duì)突觸信號(hào)的輸入、處理以及神經(jīng)環(huán)路的形成起重要作用。
　　 在對(duì)慢性高眼壓、青光眼、年齡相關(guān)性

3、黃斑變性和視網(wǎng)膜脫離等疾病的研究發(fā)現(xiàn),RGCs數(shù)量在病變過程中逐漸減少,殘留RGCs的樹突分支隨著病變的發(fā)展呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。對(duì)多種視網(wǎng)膜變性動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn),隨著感光細(xì)胞的死亡,RGCs雖然在數(shù)量上出現(xiàn)明顯減少,但是存活的RGCs形態(tài)并未發(fā)生改變并且仍然能誘發(fā)出動(dòng)作電位。既往的研究對(duì)視網(wǎng)膜變性過程中RGCs形態(tài)是否發(fā)生改變意見不一。本實(shí)驗(yàn)室既往的研究發(fā)現(xiàn),RCS大鼠(Royal college of surgeon rat,RCS)視

4、網(wǎng)膜變性過程中,RGCs數(shù)量在早期有明顯減少,其中以胞體橫徑最大的α亞型減少最為顯著,但是這些存活的α亞型RGCs在視網(wǎng)膜變性過程中形態(tài)是否發(fā)生改變未作進(jìn)一步研究。綜上所述,我們提出如下假設(shè):RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,隨著感光細(xì)胞的不斷變性死亡,視錐雙極細(xì)胞因失去信號(hào)輸入,其位于內(nèi)叢狀層的與RGCs進(jìn)行突觸聯(lián)系的軸突分支發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變,導(dǎo)致RGCs中對(duì)損傷最為敏感的α亞型RGCs在突觸形態(tài)上形態(tài)發(fā)生改變。
　　 針對(duì)以上假設(shè)

5、,本文的主要研究內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　 1、通過對(duì)視網(wǎng)膜DiI染色方法進(jìn)行改進(jìn),采用視網(wǎng)膜鋪片DiI示蹤標(biāo)記RGCs的方法,從單細(xì)胞水平對(duì)α亞型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突一二級(jí)分支數(shù)目、一級(jí)分支直徑及樹突分支頻率的變化進(jìn)行研究,了解RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中α亞型RGCs樹突的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,P21dα亞型RGCs一級(jí)分支直徑出現(xiàn)顯著增粗,但是在病程的中晚期未見改變。Α亞型RGCs一級(jí)分支直徑為何在

6、RCS大鼠變性早期出現(xiàn)顯著增粗,這種改變有何意義尚不清楚,有待于進(jìn)一步研究。2)RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,α亞型RGCs樹突分支頻率在早期P21、30d有顯著增加,而在晚期P60、90d時(shí)RGCs的樹突分支頻率顯著減少。樹突分支頻率是樹突發(fā)生分叉的次數(shù),反映了樹突數(shù)量的變化,因此,我們推測(cè)在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性早期,隨著上級(jí)神經(jīng)元數(shù)量的減少,為了接受上級(jí)神經(jīng)元的信息傳遞并與周圍神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系,α亞型RGCs代償性更早地伸出更多的樹

7、突,與周圍的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系以維持其功能,在視網(wǎng)膜變性的中晚期,即P60、90d,隨著視網(wǎng)膜各級(jí)神經(jīng)元的進(jìn)行性減少,RGCs上級(jí)神元大量缺失使神經(jīng)信息傳入減少,視網(wǎng)膜內(nèi)殘留的α亞型RGCs樹突分支也出現(xiàn)大量萎縮丟失,分支數(shù)目顯著減少。我們的研究既對(duì)α亞型RGCs的樹突一二級(jí)粗大分支數(shù)目進(jìn)行了測(cè)量,也對(duì)樹突的終末分支頻率進(jìn)行了觀察,結(jié)果表明,在視網(wǎng)膜變性過程中α亞型RGCs樹突粗大分支數(shù)目沒有明顯改變,而其終末的細(xì)小分支則出現(xiàn)了明顯的減

8、少。提示了視網(wǎng)膜變性過程中RGCs樹突形態(tài)變化主要在終末分支,這種形態(tài)學(xué)的改變可能與上級(jí)神經(jīng)元視錐雙極細(xì)胞的軸突數(shù)目減少導(dǎo)致的傳入信息減少有關(guān)。
　　 2、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,采用Recoverin特異標(biāo)記2型及8型視錐雙極細(xì)胞,觀察RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中視錐雙極細(xì)胞軸突密度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,隨著視網(wǎng)膜外核層的感光細(xì)胞進(jìn)行性缺失,Recoverin陽性視錐雙極細(xì)胞的軸突密度在P30d開始出現(xiàn)減少

9、,P90d減少更為顯著。結(jié)果提示:失去上一級(jí)信號(hào)傳入后,視錐雙極細(xì)胞的數(shù)目和軸突分支出現(xiàn)減少,這種改變可能對(duì)RGCs的信息傳入產(chǎn)生影響。
　　 綜上所述,本課題得出如下結(jié)論:
　　 1、采用視網(wǎng)膜鋪片DiI熒光染色,可以較好的觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài),對(duì)了解和分析正常及病變中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)及變化規(guī)律提供了一種簡單易行的方法。
　　 2、RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,α亞型:RGCs樹突一、二級(jí)分支數(shù)目無顯著變化,而樹

10、突分支頻率在變性過程中呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。結(jié)果提示:RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,α亞型RGCs樹突形態(tài)的改變可能主要是其樹突終末分支的萎縮和丟失,而這種形態(tài)上的改變可能是由于傳入信息減少所致,但是其在功能上發(fā)生了怎樣的改變有待于進(jìn)一步研究。
　　 3、RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中,2型和8型視錐雙極細(xì)胞軸突密度呈現(xiàn)逐漸遞減的趨勢(shì)。結(jié)果提示:在視網(wǎng)膜變性過程中,2型和8型視錐雙極細(xì)胞可能出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量的減少,并且其軸突木梢分支也