雷帕霉素通過下調(diào)DNA和RNA聚合酶抑制前B急淋白血病細胞的生長.pdf

1、目的：探究雷帕霉素(Rapamycin,Rap)對于前B淋巴細胞白血病(Pre-B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)細胞生長的影響,并探討其作用機制。
　　方法：⑴雷帕霉素處理B-ALL細胞系697細胞,分別通過苔盼蘭染色細胞計數(shù)、CCK-8試劑盒、CFSE熒光染色以及PI染色流式細胞儀分析(Flow Cytometry,FCM),分析雷帕霉素對697細胞生長、細胞活性、增殖和細胞周期的影響。

2、⑵用PI/Annexxin-Ⅴ雙染法檢測雷帕霉素處理后697細胞的凋亡水平,并構(gòu)建697-GFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)和Western blotting檢測Rap處理后的細胞自噬以及mTOR信號。⑶用細胞周期RT2 Profiler?PCR Array檢測Rap處理后細胞周期相關(guān)因子的變化。⑷用甲基綠-派洛寧染色流式法檢測Rap處理后細胞內(nèi)DNA和RNA的含量變化,并用熒光定量PCR

3、(Quantitative Real-time PCR,Q-RT-PCR)和Western blotting檢測Rap處理后與DNA和RNA合成相關(guān)的聚合酶的變化。⑸用免疫熒光技術(shù)檢測Rap處理后觀察DNA和RNA聚合酶是否與自噬小體存在亞細胞共定位。
　　結(jié)果：①100ng/ml,200ng/ml,500ng/ml雷帕霉素處理697細胞均能抑制697細胞生長,CCK-8結(jié)果顯示Rap對697細胞的IC50為100ng/ml,PI

4、染色結(jié)果顯示雷帕霉素引起細胞周期阻滯在G0/G1期。②雷帕霉素激活697細胞自噬但不影響細胞凋亡。③細胞周期RT2 Profiler?PCR Array結(jié)果顯示,雷帕霉素處理697后細胞細胞周期正調(diào)控因子下調(diào)。④雷帕霉素處理后細胞內(nèi)DNA和RNA水平降低,并且與DNA復(fù)制及RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的DNA聚合酶δⅠ和RNA聚合酶Ⅱ在RNA和蛋白水平均下調(diào)。⑤雷帕霉素激活的細胞自噬參與DNA聚合酶δⅠ和RNA聚合酶Ⅱ的下調(diào)過程。
　　結(jié)論：雷