共同抑制熱休克蛋白90和哺乳動物雷帕霉素復合物2對白血病細胞的殺傷作用.pdf

1、研究背景:
　　激酶AKT或者PKC的持續(xù)激活可促進血液腫瘤的增殖存活，并且和病人的低生存率密切相關(guān)。當前的熱點集中在對AKT激酶活性抑制劑的研究中，但我們發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素目標復合物2(mTORC2)能通過磷酸化高保守性轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域（turn motif TM）來直接調(diào)節(jié)AKT和PKC蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。細胞一旦缺乏mTORC2的功能，AKT和PKC的TM磷酸化被去除，這將損壞AKT和PCK蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。但是，分子伴侶熱休克蛋白9

2、0(HSP90)可以穩(wěn)定AKT和PKC蛋白質(zhì)，并能重新建立這兩種蛋白質(zhì)的表達。在以前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，在小鼠sin1-/-的胚胎成纖維細胞中，用17AAG抑制HSP90的功能，可抑制AKT蛋白質(zhì)的合成。在此篇論文的研究中，我們以小鼠和人的腫瘤細胞為研究對像，通過抑制mTORC2和HSP90的功能來抑制AKT蛋白質(zhì)的表達，并且我們證明在體外的培養(yǎng)環(huán)境中AKT的缺乏可抑制白血病細胞的生長并且促進白血病細胞的死亡。更進一步地我們證明17AAG

3、可以在小鼠體內(nèi)選擇性地抑制mTORC2缺陷的白血病細胞的生長。此外，我們聯(lián)合使用雷帕霉素(一種mTORC的抑制劑)和17AAG作用于白血病細胞，也可以抑制AKT蛋白質(zhì)的表達并促進白血病細胞的死亡。此項研究為臨床上聯(lián)合使用mTOR的抑制劑和熱休克蛋白抑制劑治療血液系統(tǒng)腫瘤提供了理論上的依據(jù)。本研究分為以下三部分。
　　第一部分共抑制mTORC2和HSP90對AKT的影響
　　目的: 證明在小鼠或者人的白血病細胞中同時抑制mTO

4、RC2和HSP90的功能可降解蛋白質(zhì)AKT，從而為聯(lián)合使用此兩種藥物殺傷白血病細胞提供理論基礎。
　　方法: ①用Ab-MuLV或者p210BCR-Abl病毒轉(zhuǎn)染小鼠前B淋巴細胞，從而得到白血病細胞系;②將人sin1基因片段用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染sin1缺失的白血病細胞，從而重建mTORC2的功能;③分別用17AAG或者17AAG+雷帕霉素加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)特定時間后將白血病細胞裂解取得蛋白質(zhì)，用Western Blot方法檢測AKT蛋白

5、質(zhì)的含量;
　　結(jié)果: ①將HSP90抑制劑作用于mTORC2缺失的白血病細胞，4小時后即可觀察到AKT蛋白質(zhì)的降解;②將HSP90抑制劑作用于mTORC2重建的白血病細胞，mTORC2功能的重建可以保護蛋白質(zhì)AKT，從而使其免于降解;③同時將mTORC2的抑制劑-雷帕霉素和HSP90的抑制劑-17AAG作用于白血病細胞，也可觀察到AKT蛋白質(zhì)的降解。
　　結(jié)論: 同時抑制mTORC2和HSP90的功能可在白血病細胞內(nèi)降解蛋

6、白質(zhì)AKT。
　　第二部分共抑制mTORC2和HSP90體外對白血病細胞的作用
　　目的: 證明在體外環(huán)境中，白血病細胞缺乏蛋白質(zhì)AKT可抑制其生長以及促進其死亡。
　　方法: 分別用17AAG或者17AAG+雷帕霉素加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)特定時間后①用PI與AnnexinⅤ雙染法檢測凋亡與死亡細胞;②用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞。
　　結(jié)果: ①將HSP90抑制劑-17AAG作用于mTORC2缺失的白血病細胞，可觀察到細

7、胞停止生長并出現(xiàn)更多的死亡和凋亡細胞;②將HSP90的抑制劑-17AAG作用于mTORC2重建的白血病細胞，mTORC2功能的重建可以保護白血病細胞，減少細胞死亡;③同時將mTORC2抑制劑和HSP90的抑制劑作用于白血病細胞，可觀察到白血病細胞停止生長并出現(xiàn)更多的死亡和凋亡細胞。
　　結(jié)論: 同時抑制mTORC2和HSP90的功能降解了AKT后可在體外抑制白血病細胞的生長并促進其死亡。
　　第三部分共抑制mTORC2和HS

8、P90在小鼠體內(nèi)的抗白血病效應
　　目的: 證明在小鼠體內(nèi)環(huán)境中，同時抑制mTORC2和HSP90的功能降解蛋白質(zhì)AKT后可減少白血病細胞的存活。
　　方法: 6-8周齡健康成年P(guān)eb3b(CD45.1+)小鼠，體重20-24g。經(jīng)亞致死量放射處理(300cGy)后隨機分為WT對照組，WT藥物治療組，KO對照組，KO藥物治療組。WT對照組為:經(jīng)尾靜脈注射2x106個WT p210 BCR-Abl白血病細胞，并且經(jīng)腹腔注射藥物

9、載體（玉米油）;WT藥物治療組:經(jīng)尾靜脈注射2x106個WT p210BCR-Abl白血病細胞，并且經(jīng)腹腔注射藥物17AAG; KO對照組為:經(jīng)尾靜脈注射2x106個sin1-/-p210 BCR-Abl白血病細胞，并且經(jīng)腹腔注射藥物載體（玉米油）;KO藥物治療組:經(jīng)尾靜脈注射2x106個sin1-/-p210 BCR-Abl白血病細胞，并且經(jīng)腹腔注射藥物17AAG.藥物劑量為80mg/kg/天，從移植完成24h后起，持續(xù)5天。小鼠在結(jié)

10、束藥物注射2天后被處死。用流式細胞術(shù)分析骨髓細胞中Sin1+/+或者sin1-/-白血病細胞的比例。
　　結(jié)果: ①經(jīng)HSP90抑制劑-17AAG處理一周后，小鼠骨髓中sin1-/-p210 BCR-Abl的白血病細胞少于野生型小鼠骨髓中的白血病細胞;②經(jīng)HSP90抑制劑處理一周后，、小鼠肝臟中的sin1-/-p210BCR-Abl白血病細胞少于野生型小鼠肝臟中的白血病細胞。
　　結(jié)論: 同時抑制mTORC2和HSP90的功