核因子-κB信號通路參與人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖-凋亡調(diào)節(jié).pdf

1、目的:探討核因子κ B(Nuclear Factor—κ B,NF—κ B)信號通路是否參與調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的增殖及凋亡作用。
　　 材料和方法:(1)貼壁法獲取骨髓間充質(zhì)干細胞:取股骨頭置換或全髖關(guān)節(jié)置換患者股骨髓腔內(nèi)骨髓血混合物,通過差速貼壁法分離培養(yǎng)純化鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞,進行形態(tài)學(xué)觀察。(2)流式細胞術(shù)鑒定表面分子表達:采用細胞表面分子標志流

2、式抗體熒光染色后,用流式細胞方法檢測細胞表面分子表達。(3)應(yīng)用蛋白凝膠電泳(western blotting)的方法檢測藥物干預(yù)(激活劑脂多糖,Lipopolysaccharides,LPS；抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽,PDTC)后NF—κ B表達水平以及增殖、凋亡相關(guān)蛋白變化。(4)另用蛋白凝膠電泳分別檢測相關(guān)蛋白如PARP、PCNA等蛋白表達的變化。(5)細胞增殖檢測:用MTT比色方法檢測骨髓間充質(zhì)干細胞在LPS及PDTC的作用

3、下其增殖的變化。(6)細胞凋亡檢測:通過將細胞標記PI后進行流式細胞分析檢測在NF—κ B信號通路激活后細胞凋亡變化。
　　 結(jié)果:(1)從手術(shù)中人股骨髓腔內(nèi)收集的骨髓能夠分離培養(yǎng)純化出骨髓間充質(zhì)干細胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察,其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與間充質(zhì)干細胞外觀一致。(2)流式細胞術(shù)檢測顯示該細胞表面表達分子與間充質(zhì)干細胞表達分子一致,證實本實驗培養(yǎng)細胞即為間充質(zhì)干細胞。(3)向純化的骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)分別及同時加入脂多糖(LPS,1ug/m

4、l)和吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC,25mM)后,在LPS作用下,NF-κ B通路中蛋白p65表達水平升高,提示NF—κ B通路激活。(4)其他相關(guān)蛋白表達也受到影響,增殖相關(guān)蛋白PCNA及凋亡相關(guān)蛋白PARP發(fā)生相關(guān)變化(經(jīng)統(tǒng)計P<0.05)。(5)細胞增殖實驗顯示,hMSCs在LPS刺激下,細胞短期內(nèi)增殖受到刺激作用(經(jīng)統(tǒng)計P<0.05)。(6)流式細胞分析顯示,NF—κ B信號通路激活后,骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡水平較正常降低,抑