NF-кB信號通路在間充質干細胞調節(jié)巨噬細胞治療燒傷膿毒癥的作用研究.pdf

1、燒傷膿毒癥的發(fā)生機制及治療方法一直是研究的熱點與重點。間充質干細胞具有較強的抗炎、免疫調節(jié)作用,可通過旁分泌各種細胞因子或與各種免疫細胞相互調節(jié)而發(fā)揮作用,用于炎癥性或免疫性疾病的治療。近年來已經(jīng)在 GVHD、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、急性肺損傷、急性腎功能損害、急性免疫性肝損傷等疾病,脂肪間充質干細胞取得了明顯的治療效果,但是針對嚴重燒傷膿毒癥的治療研究仍然甚少,且具體機制仍不十分清楚。
　　首先,建立一個有效的完全模擬膿

2、毒癥發(fā)病機制的動物模型及分離擴增培養(yǎng)獲得大量脂肪間充質干細胞非常關鍵。在第一部分實驗,以C57/BL6J小鼠10％III°燙傷創(chuàng)面,接種2×105 CFU銅綠假單胞菌建立小鼠燒傷膿毒癥模型。實驗結果:具有穩(wěn)定的膿毒癥發(fā)病率及死亡率,死亡率達50%-80%,;IL-1、IL-6、TNF-a及CRP等炎性因子明顯升高,IL-6最高達20ng/ml;心、肝、脾、肺及腎臟細菌含量增高,其中脾臟含量最高;各臟器炎性細胞浸潤及炎癥損傷嚴重,可見大量

3、的炎性細胞浸潤及血性滲出;ALT、AST、BUN、Cr持續(xù)升高,腎功及肝功能明顯下降。該實驗表明該燒傷膿毒癥模型有較高的死亡率和可重復的穩(wěn)定性,并可進一步可發(fā)展為SIRS和MODS;該模型較好的反應了燒傷膿毒癥的病理機制及臨床特征。
　　在第二部分實驗采用酶消化、貼壁篩選以及差速離心法分離培養(yǎng)小鼠脂肪間充質干細胞,通過流式細胞分析獲得90%以上的CD90、CD105、CD44表達陽性,以及90%以上的CD34、CD45表達陰性的;

4、同時通過油紅O及堿性磷酸酶染色證明該細胞是有向成脂、成骨多向分化能力的脂肪來源的間充質干細胞。
　　在第三部分實驗在膿毒癥模型制備6h后,運用2×105脂肪間充質干細胞輸注治療小鼠燒傷膿毒癥,觀察小鼠的一般狀況、生存率,檢測全身各臟器細菌及內毒素定量、各臟器功能,以及促炎/抗炎因子的改變,明確脂肪間充質干細胞在燒傷膿毒癥的治療作用。實驗結果表明:1、小鼠一般狀況、自主活動及對外界的反應都有明顯改善;2、小鼠24h、48h至72h臟

5、器的細菌含量明顯減少,而脾臟細菌定量變化最大,心臟的變化最小;3、隨時間延長,TNF-α、IL-12表達明顯下降及抗炎因子IL-10表達明顯升高,血清中TNF-α、IL-6等促炎癥因子及抗炎因子IL-10變化也是相同的。4、各臟器組織HE染色示炎性細胞浸潤明顯減少,肝小葉放射狀結構保持完整;腎臟組織腎小管壞死細胞明顯減少,肺間質增厚及肺泡內的血性滲出明顯改善,肝、肺及腎臟組織細胞壞死凋亡明顯減少,臟器功能得到改善。這些實驗結果表明,脂肪

6、間充質干細胞治療燒傷膿毒癥得到了肯定的療效。
　　在第四部分實驗體外單獨或共培養(yǎng)脂肪間充質干細胞與 Raw264.7小鼠巨噬細胞,以探討脂肪間充質干細胞調節(jié)巨噬細胞及其NF-кB信號通路在干細胞治療膿毒癥可能的作用機制。將細胞分為四組:正常對照組、LPS刺激組、Transwell組、混合細胞組。實驗結果證明:1、經(jīng) LPS刺激后,促炎因子 TNF-a、IL-6及抗炎因子TGF-b均有明顯升高,但隨時間延長,抗炎因子迅速下降,而促炎

7、因子持續(xù)升高;當細胞共培養(yǎng)時,促炎因子明顯下降,抗炎因子明顯升高,其中促炎因子 TNF-a,及抗炎因子COX-2變化最明顯。2、經(jīng)LPS刺激24h后,CD206陽性細胞增幅10%;隨時間延長,LPS刺激組CD206陽性細胞無明顯變化;但細胞Transwell及混合細胞共培養(yǎng)組,分別由23.3%增至38.5%,24.2%增至52.7%,較LPS刺激組有顯著的提高,且發(fā)現(xiàn),混合細胞組 CD206的細胞比例最高,具有統(tǒng)計學差異。3、間充質干細