實(shí)驗(yàn)用小型豬細(xì)胞色素P450家族新基因克隆及其CYP3A29基因多態(tài)研究.pdf

1、一、研究目的及背景： 作為藥物評(píng)價(jià)模型，要求模型動(dòng)物的藥物代謝反應(yīng)機(jī)制以及藥物與機(jī)體與之間的相互作用方面與人具有相似性，利用模型動(dòng)物能夠較為準(zhǔn)確地模擬藥物在人體內(nèi)的代謝過(guò)程。藥物在體內(nèi)的過(guò)程大致可以分為吸收、分布、代謝和排泄四個(gè)階段。藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其生物利用度、毒副作用及藥物相互作用都由這四個(gè)階段決定。其中藥物代謝的主要場(chǎng)所是肝臟。肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化則依賴于微粒體中的多種酶系，其中最重要的是細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶系

2、統(tǒng)。由于該酶系廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤(pán)等組織器官，因此由P450酶系催化的氧化還原反應(yīng)可發(fā)生在體內(nèi)許多部位，但仍然以肝臟為主。 P450酶系普遍存在于各種脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中。該酶系組成復(fù)雜，由基因多樣性控制，稱為P450基因超家族。到目前為止，根據(jù)最新公布的數(shù)據(jù)，僅動(dòng)物就存在101個(gè)P450家族，2345個(gè)基因序列。P450基因家族和人類的個(gè)體化用藥及藥物的毒副作用密切相關(guān)，因此人類的

3、P450已經(jīng)研究得比較深入，目前發(fā)現(xiàn)57個(gè)P450功能基因。而作為成熟模式生物和人類疾病動(dòng)物模型的小鼠則已發(fā)現(xiàn)102個(gè)P450功能基因。豬作為一種具有重要應(yīng)用前景的藥物評(píng)價(jià)動(dòng)物及醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其P450基因的研究相對(duì)缺乏，目前通過(guò)國(guó)際細(xì)胞色素P450命名委員會(huì)命名的僅有30個(gè)功能基因。 本研究利用公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列資源，用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)豬的細(xì)胞色素P450新基因，以此對(duì)我國(guó)資源小型豬品系巴馬香豬進(jìn)行相關(guān)基因的克隆，為我國(guó)

4、獨(dú)特小型豬品系作為藥物評(píng)價(jià)動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)依據(jù)：同時(shí)研究巴馬香豬和貴州小型香豬細(xì)胞色素P450關(guān)鍵亞型CYP3A29的品系間及品系內(nèi)多態(tài)性，評(píng)估其序列多態(tài)差異對(duì)藥物代謝動(dòng)物模型的影響；對(duì)兩種小型豬品系進(jìn)行微衛(wèi)星遺傳背景檢測(cè)分析，觀察動(dòng)物品系間與品系內(nèi)微衛(wèi)星遺傳背景差異與其CYP3A29基因多態(tài)的相互關(guān)系。 二、研究?jī)?nèi)容和結(jié)果： 1.豬細(xì)胞色素P450基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析 根據(jù)其它哺乳動(dòng)物的同源P450基因序

5、列，主要利用豬現(xiàn)有的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，用生物信息學(xué)方法對(duì)豬P450家族基因進(jìn)行電子克隆，獲得豬細(xì)胞色素P450家族新基因；并對(duì)豬細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行EST電子表達(dá)譜、可變剪接等分析。結(jié)果：應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)獲得37個(gè)可能的豬細(xì)胞色素P450新基因序列，利用EST電子表達(dá)分析獲得了豬不同組織的P450基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了豬P450基因的46個(gè)可變剪接體，為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。通過(guò)生物信息學(xué)方法共得到3

6、7個(gè)可能的豬細(xì)胞色素P450薪基因序列，分布于11個(gè)家族，19個(gè)亞家族.23個(gè)亞型。其中9條具有全長(zhǎng)編碼區(qū)序列。序列分析表明預(yù)測(cè)得到的序列均具有P450結(jié)構(gòu)域或與其它物種相應(yīng)P450序列高度相似，聚類分析表明其和已知豬的P450基因或人的相應(yīng)P450基因具有同源性。對(duì)已知和預(yù)測(cè)的共52個(gè)豬P450基因進(jìn)行EST電子表達(dá)譜分析，獲得了其不同組織的P450基因表達(dá)數(shù)據(jù). 2.巴馬香豬預(yù)測(cè)細(xì)胞色素P450基因的克隆和驗(yàn)證 根據(jù)

7、對(duì)豬細(xì)胞色素P450基因序列的預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因序列，進(jìn)行TA克隆和序列測(cè)定，與預(yù)測(cè)的P450基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果：克隆獲得了我國(guó)資源小型豬品系巴馬香豬的18個(gè)細(xì)胞色素P450新基因序列，均已在GenBank登錄，登錄號(hào)。EF625344-EF625358，并已提交國(guó)際細(xì)胞色素P450命名委員會(huì)進(jìn)行命名，不僅為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因序列資料，同時(shí)表明用生物信息學(xué)方法結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是快速高效獲得豬

8、P450新基因的有效途徑。對(duì)預(yù)測(cè)的豬細(xì)胞色素P450基因19個(gè)序列的RT-PCR克隆驗(yàn)證均獲得了符合預(yù)期片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)序列測(cè)定和比對(duì)，17個(gè)P450基因的克隆序列和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，1個(gè)克隆序列可能為豬cyp4f6.基因的一個(gè)新等位基因。其中1個(gè)克隆序列cyp4f2v4和預(yù)測(cè)序列相差較大，blastx檢索NCBI未發(fā)現(xiàn)相似P450序列，因此把這條序列不作為豬的P450基因序列。cyp4f3vl的擴(kuò)增序列和原來(lái)差異較大，

9、但和cyp4f6v1序列非常相似，并能和cyp4f6vl*1、cyp4f6vl*2、cyp4f6v1*3其同拼接成一條contig，將這條contig用blastx檢索NCBI，未發(fā)現(xiàn)相同序列，但和CYP4F6亞家族有高度相似，故其應(yīng)為豬cyp4f6基因的一個(gè)新變體。 3.小型豬細(xì)胞色素P450基因CYP3A29多態(tài)研究 設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增不同個(gè)體巴馬香豬和貴州小型香豬的CYP3A29基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，進(jìn)行TA克

10、隆和測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點(diǎn)，并對(duì)其多態(tài)位點(diǎn)的分布和影響進(jìn)行分析。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)了巴馬香豬和貴州小型香豬CYP3A29基因的6個(gè)SNP位點(diǎn)及1個(gè)可變剪接體，其SNP分布具有品系及個(gè)體間多態(tài)性，在不同品系中可呈不同的SNP類型，其中巴馬香豬具有品系內(nèi)SNP類型的一致性，貴州小型香豬品系內(nèi)具有SNP類型差異，說(shuō)明豬P450基因具有和人相似的遺傳多態(tài)性，在豬作為藥物代謝模型的應(yīng)用中應(yīng)關(guān)注品系及個(gè)體間的差異。共獲得13頭巴馬香豬和5

11、頭貴州小型香豬的CYP3A29基因序列，比對(duì)結(jié)果表明，其中具有6個(gè)可能的SNP位點(diǎn)，1個(gè)可變剪接體，1個(gè)可能的豬CYP3A29亞家族新基因。6個(gè)可能的SNP位點(diǎn)中，5個(gè)均為同義替換，不改變編碼的氨基酸類型，對(duì)編碼的蛋白序列無(wú)影響，1個(gè)由于堿基缺失引起移碼突變和翻譯提前終止。CYP3A29*1A、CYP3A29*1B、CYP3A29*1C三個(gè)SNP位點(diǎn)，均表現(xiàn)為品系間的差異，即巴馬香豬和貴州小型香豬各為一個(gè)SNP亞型；位點(diǎn)CYP3A29*

12、1E和CYP3A29*2則表現(xiàn)小型豬品系和其它品系間的序列差異：CYP3A29*1D位點(diǎn)1頭貴州小型香豬和其它貴州小型香豬為不同的SNP類型。貴州小型香豬G3a2902發(fā)現(xiàn)一個(gè)可變剪接，其在499-587位發(fā)生片段缺失，并產(chǎn)生移碼使編碼蛋白被截?cái)唷Ｔ诎婉R香豬B3a2914發(fā)現(xiàn)一個(gè)非特異序列，其可能是豬CYP3A亞家族的一個(gè)新成員。 4.實(shí)驗(yàn)小型豬群體的微衛(wèi)星遺傳學(xué)檢測(cè) 選用美國(guó)豬基因組協(xié)作計(jì)劃推薦用于全球豬遺傳多樣性研究

13、的21個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用微衛(wèi)星熒光標(biāo)記.半自動(dòng)基因分型方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的2個(gè)小型豬群體.巴馬香豬和貴州小型香豬進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)和評(píng)估，鑒定其遺傳背景和遺傳關(guān)系，分析其個(gè)體間相似性和差異程度。結(jié)果：巴馬香豬和貴州小型香豬具有較好遺傳穩(wěn)定性，群體內(nèi)具有良好遺傳多樣性，巴馬香豬的個(gè)體均一性要好于貴州小型香豬，兩群體間有較大遺傳差異，其遺傳穩(wěn)定性說(shuō)明兩種小型豬是適宜醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與人群的遺傳狀況相似；同時(shí)其品系間及品系內(nèi)的遺傳差

14、異與其P450基因的SNP多態(tài)分布相符，進(jìn)一步說(shuō)明在豬作為藥物代謝模型的應(yīng)用中應(yīng)關(guān)注品系及個(gè)體間的差異。兩種小型豬及對(duì)照榮昌豬和大白豬在所檢21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有良好遺傳多樣性，共檢測(cè)到等位基因281個(gè)，每位點(diǎn)7-22個(gè)，巴馬香豬、貴州小型香豬、榮昌豬、大白豬分別為132、125、174和119個(gè)，巴馬香豬檢測(cè)到的等位基因數(shù)要大于貴州小型香豬，但巴馬香豬的遺傳多樣性指數(shù)Shannon信息指數(shù)和多態(tài)信息含量均低于貴州小型香豬，其遺傳雜合度

15、低于貴州小型香豬，純合度高于后者，提示巴馬香豬個(gè)體間的相似程度要大于貴州小型香豬。兩種小型豬間的遺傳分化指數(shù)Fst為0.2270，Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離為0.9134，提示其群體間遺傳分化較大，具有較大遺傳差異。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)表明，兩種小型豬的21個(gè)位點(diǎn)中均有7個(gè)偏離平衡，榮昌豬和大白豬則分別有10和11個(gè)偏離平衡，表明兩種小型豬在繁育過(guò)程中能夠較好地保持遺傳穩(wěn)定性。 三、研究結(jié)論： 1.應(yīng)用生物信

16、息學(xué)方法預(yù)測(cè)獲得37個(gè)可能的豬細(xì)胞色素P450新基因序列，分布于11個(gè)家族，19個(gè)亞家族，23個(gè)亞型；利用EST電子表達(dá)分析獲得了豬不同組織的P450基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了豬P450基因的46個(gè)可變剪接體。為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。 2.克隆獲得了我國(guó)資源小型豬品系巴馬香豬的18個(gè)細(xì)胞色素P450新基因序列，均已在GenBank登錄，登錄號(hào)EF625344-EF625358，并已提交國(guó)際細(xì)胞色素P45

17、0命名委員會(huì)進(jìn)行命名，不僅為小型豬藥物代謝研究提供了P450基因序列資料，同時(shí)表明用生物信息學(xué)方法結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是快速高效獲得豬P450新基因的有效途徑。 3.發(fā)現(xiàn)了巴馬香豬和貴州小型香豬CYP3A29基因的6個(gè)SNP位點(diǎn)及1個(gè)可變剪接體，其SNP分布具有品系及個(gè)體間多態(tài)性，在不同品系中可里不同的SNP類型，其中巴馬香豬具有品系內(nèi)SNP類型的一致性，貴州小型香豬品系內(nèi)具有SNP類型差異，說(shuō)明豬P450基因具有和人相似的遺傳多態(tài)性，