攜帶HCC表位的HBc-VLPs的制備及其負(fù)載的DCs誘導(dǎo)抗原特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、目的： 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率很高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。HCC起病隱匿，發(fā)生發(fā)展迅猛，手術(shù)切除率和術(shù)后生存率均較低，所以一直以來(lái)它的臨床療效和預(yù)后均不理想。目前在手術(shù)、化療、放療之后輔以免疫治療越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視。但是，腫瘤的低免疫原性和機(jī)體對(duì)腫瘤的低免疫反應(yīng)性，使得免疫治療的應(yīng)用受到限制。目前，樹(shù)突狀細(xì)胞(dentritic cells，DCs)的免

2、疫呈遞作用在提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)中得到進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，尤其是DCs細(xì)胞在快速誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫記憶形成、通過(guò)分泌特定細(xì)胞因子抑制CD4+CD25+T細(xì)胞的功能及誘導(dǎo)針對(duì)非優(yōu)勢(shì)抗原表位免疫應(yīng)答等方面占有優(yōu)勢(shì)，因而DCs細(xì)胞己成為研發(fā)腫瘤疫苗的一個(gè)熱點(diǎn)，所以研制一種有效的肝癌DC疫苗來(lái)激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答以達(dá)到控制此類(lèi)疾病的目的是疫苗學(xué)急需解決的問(wèn)題。 但是隨著對(duì)腫瘤免疫治療研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)

3、自身的一些代謝產(chǎn)物使荷瘤宿主體內(nèi)DCs的數(shù)量、表型及其功能發(fā)生異常變化，從而抑制DCs的成熟和抗原遞呈功能，使機(jī)體抗腫瘤免疫受到抑制，使腫瘤細(xì)胞得以逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用。目前許多研究者應(yīng)用腫瘤抗原，如腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)性抗原及完全細(xì)胞性抗原體外沖擊致敏DCs，使其避開(kāi)腫瘤的抑制作用，把經(jīng)過(guò)修飾的DCs疫苗輸回體內(nèi)，結(jié)果可以有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，但免疫應(yīng)答一般不能維持。近期的研究表明，這可能是由于抗原負(fù)載后的DCs

4、的抗原遞呈能力較弱，或者負(fù)載抗原后DCs的壽命降低，因此很難誘導(dǎo)長(zhǎng)效的T細(xì)胞應(yīng)答。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白都具有自動(dòng)組裝成VLPs的能力。它在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。由于VLPs不含有病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性，其中有些已經(jīng)作為疫苗成功應(yīng)用于臨床。研究表明，VLPs在沒(méi)有任何佐劑的情況下即可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞與體液免

5、疫應(yīng)答，并可以通過(guò)交叉遞呈的方式將抗原表位遞呈給CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。最重要的是，VLPs在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并將外源性抗原展示在其表面，這個(gè)特點(diǎn)就為人們研究疫苗提供了更加廣闊的前景。 黑色素瘤抗原(melanoma antigen，Mage)在正常組織中除睪丸和胎盤(pán)組織外均不表達(dá)，但在某些惡性腫瘤如肝細(xì)胞癌中高度特異表達(dá)，其中MAGEl，MAGE3表達(dá)最高。甲胎蛋白(AFP)是肝癌

6、細(xì)胞分泌性蛋白，也是肝癌的特異性蛋白。本研究選取高表達(dá)于HCC的HLA-A2限制的CTL表位MAGE-1第278-286位(KVLEYVIKV)、MAGE-3第271-279位(FLWGPRALV)、AFP第158-166位(FMNKFIYEI)和AFP第542-550位(GVALQTMKL)氨基酸插入至截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端，構(gòu)建了單表位和多表位嵌合基因至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a，中，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)、純化，

7、得到顆粒性表達(dá)產(chǎn)物王IBc-VLPs，負(fù)載DCs后作為肝癌的候選疫苗利用}玎LA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)此DC疫苗的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)抗原特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和抗腫瘤效應(yīng)，探索其作為兼具預(yù)防和治療肝細(xì)胞癌作用的新型疫苗的可能性。 方法： 1.獲得單表位融合基因利用巢式PCR.技術(shù)獲得四種抗原表位肽M1(MAGE-1278-286aa)、M3(MAGE-3271-279aa)、A1(AFPl58-166aa)和A

8、2(AFP542-550aa)基因，并通過(guò)GA連接子將它們分別插入到截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端，得到單表位融合基因HBc-M1、HBc-M3、HBc-A1和HBc-A2。 2.獲得多表位融合基因通過(guò)PCR的方法得到含有多表位的抗原肽S1(AFPl-Th表位-AFP2)和S2(MAGEl-MAGE3-Th表位)基因，并通過(guò)GA連接子將它們分別插入到截短的HBcAg(1-144aa)基因3’末端，得到多表位融合基因

9、HBc-S1和HBc-S2。 3.構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HBc-抗原表位將上述六種融合基因連入原核表達(dá)載體pET28a，然后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)受體菌，經(jīng)PCR及抽提質(zhì)粒雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆。抽提陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。 4.HBc-抗原表位融合蛋白的獲得構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)改變IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及葡萄糖加入量等條件優(yōu)化蛋白表達(dá)，目的蛋白主要以包涵體形式存在。蛋

10、白經(jīng)2M、4M、6M尿素梯度洗滌變性后用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，經(jīng)復(fù)性透析后得到嵌合病毒樣顆粒蛋白HBc-VLPs，用SDS-PAGE、Western-blot、ELISA和透射電鏡觀察等方法分析鑒定嵌合蛋白分子量大小及其抗原性和顆粒性。 5.HBc-VLPs負(fù)載的DCs誘導(dǎo)長(zhǎng)效CTL活性及抗腫瘤作用研究。 將制備的HBc-VLPs分別與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源的DCs共孵育，做細(xì)胞涂片并行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色

11、，用激光共聚焦顯微鏡觀察DCs胞漿內(nèi)攝入的蛋白顆粒；通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)觀察其能否被DCs提呈從而刺激naiveT細(xì)胞增殖。利用轉(zhuǎn)基因小鼠荷瘤模型，對(duì)HBc-VLPs負(fù)載的DC疫苗抑瘤作用及對(duì)小鼠抗原特異性淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌和CTL活性進(jìn)行了觀察，并與抗原肽負(fù)載的DC疫苗進(jìn)行了對(duì)比。 結(jié)果： 構(gòu)建6種HBV嵌合型顆粒蛋白的原核表達(dá)載體pET28a-HBc-A1、pET28a-HBc-A2、pET28a-H

12、Bc-M1、pET28a-HBc-M3、pET28a-HBc-S1和pET28a-HBc-S2，其中3種目的蛋白HBc-A1、HBc-Ml和HBc-M3在大腸桿菌中以包涵體形式獲得表達(dá)。經(jīng)過(guò)梯度尿素洗滌，目的蛋白主要溶于6M尿素中，再經(jīng)Ni-NTA親和層析純化和復(fù)性后，蛋白純度達(dá)90％以上。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白HBc-A1、HBc-M1和HBc-M3均具有病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)，Westem-blot和ELISA證實(shí)嵌合蛋白保留了HBc

13、抗原性。 此外，3種HBc-VLPs分別與體外培養(yǎng)5天的小鼠BMDCs共孵育后，激光共聚焦顯微鏡即可觀察到DCs胞漿內(nèi)有攝入的蛋白顆粒。進(jìn)一步通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)還觀察到，VLPs與DCs共培養(yǎng)24h，可以強(qiáng)烈刺激naive T細(xì)胞增殖。因此，包涵體變性蛋白經(jīng)復(fù)性可以得到正確折疊的、結(jié)構(gòu)完整的VLPs，且可以被DCs攝取和有效遞呈。在分析HBc-VLPs負(fù)載DCs的免疫效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，HBc-VLPs負(fù)載的DCs免疫小鼠后

14、第8天，流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)到分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞存在，用LDH法檢測(cè)到較強(qiáng)的抗原特異性CTL活性。小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說(shuō)明，給荷瘤B16-pIR-HH5天的小鼠，用HBc-VLPs負(fù)載的DCs免疫后，在腫瘤接種的20天之前均未見(jiàn)到明顯的腫瘤塊，而陰性對(duì)照組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)很快，且小鼠死亡率高(荷瘤存活鼠為1/6)，但在荷瘤的20d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤開(kāi)始生長(zhǎng)。 結(jié)論： 1.本研究建立了攜帶HCC抗原表位的HBc-