多維液相色譜質(zhì)譜組合分析在志賀菌蛋白組基因組學中的應用.pdf

1、隨著全基因組測序分析技術(shù)的快速發(fā)展，大量生物體的全基因組序列分析工作相繼完成。對這些基因組的精確注釋是其它組學研究的源泉和基礎。目前，盡管通過生物信息學方法預測蛋白編碼基因的可靠性在提高，但是由于其局限性仍會引起不少注釋錯誤和遺漏。近年來，利用蛋白質(zhì)組學方法完善基因組注釋成為國際上的一個研究熱點。由此誕生了一門新興學科一蛋白組基因組學(proteogenomics)，通過將質(zhì)譜鑒定出的肽段定位到相應的基因組骨架上，從而把蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)和

2、基因組注釋進行有機整合。發(fā)展快速高通量的蛋白組基因組學研究方法仍是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。研究表明二維液相色譜聯(lián)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（2-DLC-MALDI-TOF/TOF）和二維液相色譜聯(lián)用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(2-DLC-ESI-MS/MS)的多維液相色譜質(zhì)譜的組合分析可以提高鑒定蛋白的覆蓋率，但目前還未見這種技術(shù)方法在基因組注釋中的應用。我們實驗室率先在國際上完成了志賀菌所有四個血清群代表株的全基因組序列分析工作，這使

3、其成為一個理想的蛋白組基因組學研究對象。
　　 本研究擬構(gòu)建2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS的組合分析體系以期有效地完善福氏志賀菌的基因組注釋。
　　 首先根據(jù)溶解性的不同對福氏2a志賀菌301株（S.flexneri2astr.301，Sf301）的全蛋白樣品進行預分離，順序抽提胞漿蛋白和膜蛋白，經(jīng)胰酶消化后通過離線的2-DLC-MALDI-TOF/TOF和在線的2-DLC-ESI

4、-MS/MS的組合鑒定分析，所用檢索數(shù)據(jù)庫為福氏2a志賀菌301株的6個讀碼框數(shù)據(jù)庫，搜索引擎分別為MASCOT和SEQUEST。最終結(jié)果如下：
　　 從蛋白水平驗證了1231個已注釋基因的表達，其在等電點pI、分子量MW和疏水性GRAVY方面的分布趨勢與福氏2a志賀菌301株基因組已注釋的4443個蛋白產(chǎn)物的分布一致。同時鑒定的蛋白涵蓋了蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(clustersoforthologousgroupsofprot

5、eins，COGs)22功能分類組中20個，提示組合鑒定能夠較好的體現(xiàn)了所用生物樣品的蛋白質(zhì)組構(gòu)成情況；確認了306個假定(hypothetical)基因的表達，占福氏2a志賀菌301株總假定基因的16％;借助獨創(chuàng)的“N-末端延伸數(shù)據(jù)庫”分析方法和RT-PCR的進一步驗證,3個基因(yhdP、yebJ和smpA)的翻譯起始位點得到修正;另外發(fā)現(xiàn)兩個由于測序錯誤造成的注釋錯誤：假基因zwf更正為“6-磷酸葡萄糖脫氫酶”的編碼基因，fusA

6、的3'末端往下游延伸240bp;完善基因組注釋最突出的貢獻是發(fā)現(xiàn)了34個未注釋的新基因，其中包括5個在其他腸道桿菌有注釋而在福氏2a志賀菌301株未注釋的基因以及29個全新的基因。9個新基因得到了RT-PCR或Northernblot的進一步驗證。這些新基因的功能值得進一步研究。
　　 本研究還對2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS組合體系本身進行了綜合分析和比較。在對鑒定肽的性質(zhì)比較中發(fā)現(xiàn)，M

7、ALDI更傾向于離子化偏短的、堿性的、胰酶消化后C末端為精氨酸的肽段；ESI更傾向于離子化偏長的、疏水性的、胰酶消化后C末端為賴氨酸的肽段。經(jīng)過優(yōu)化組合，該組合分析體系大大提高了鑒定蛋白質(zhì)的“質(zhì)”和“量”。
　　 綜上所述，我們首次將2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS組合體系應用到完善基因組注釋工作中。由于MALDI和ESI的互補性，這種組合分析體系無論在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量上還是可信程度上都要優(yōu)于