日本血吸蟲Vasa3基因定位與功能的初步研究.pdf

1、目的:利用原位雜交技術(shù)對日本血吸蟲各期蟲體進(jìn)行整蟲基因定位，初步判斷Vasa3在日本血吸蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)揭示Vasa3基因在血吸蟲生殖、發(fā)育中所具有的功能；通過本研究期望發(fā)現(xiàn)可干預(yù)和抑制血吸蟲生殖發(fā)育的關(guān)鍵靶標(biāo)，為研發(fā)抑制血吸蟲蟲卵發(fā)育及活性的藥物或制劑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探索控制血吸蟲病流行和減輕血吸蟲對人體危害新途徑。
　　方法:利用BLAST軟件，篩選特異性序列作為Vasa3基因原位雜交RNA探針片

2、段，以血吸蟲成蟲cDNA為模板，普通PCR擴(kuò)增獲得314bp特異性片段,重組到pspT-18載體，體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛反義RNA探針。對日本血吸蟲24、36、及42天成蟲通過漂白、透膜、雜交、顯色等處理后，封片觀察。以Vasa3為靶基因，合成3個(gè)不同靶區(qū)域的siRNA（V1，V2和V3）,實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定有效靶點(diǎn)后，構(gòu)建包裝表達(dá)shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒載體，與PVSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞后，48h收取細(xì)胞上清，通過超速離心法濃縮

3、病毒，Retro-X qRT-PCR Titration Kit進(jìn)行病毒滴定。用針對日本血吸蟲Vasa3 shRNA的病毒感染日本血吸蟲18天成蟲，分別在RNA干擾后7天觀察Vasa3基因及蛋白表達(dá)水平，于14天通過激光共聚焦顯微鏡觀察生殖系統(tǒng)形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:通過整蟲原位雜交，在日本血吸蟲24、36及42天雌蟲卵巢和卵黃腺可見強(qiáng)烈雜交陽性信號，在雄蟲中未見明顯陽性信號，由此結(jié)果顯示Vasa3基因在雌蟲卵巢和卵黃腺高表達(dá)。s

4、iRNA篩選結(jié)果顯示 V2組靶序列（5’-cuaaacgcggagcugauautt-3’）具有較好的干擾效果，以此序列成功構(gòu)建含人U6啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PLNHX_HsU6_Vasa3。與PVSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞后，成功包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒并測定滴度為5×107cfu/ml。感染日本血吸蟲后RT-PCR顯示Vasa3基因水平較對照組下降69％。激光共聚焦顯微鏡觀察蟲體生殖系統(tǒng)形態(tài)結(jié)果顯示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組雄蟲睪丸變小

5、，包膜不規(guī)整，睪丸內(nèi)細(xì)胞形態(tài)雜亂，分界不清。雄蟲卵巢內(nèi)細(xì)胞減少，細(xì)胞分界不清，結(jié)構(gòu)紊亂。
　　結(jié)論：本課題首先通過Vasa3在生殖系統(tǒng)定位的明確，初步證實(shí)Vasa3可能參與血吸蟲雌蟲生殖器官的發(fā)育并可做為雌性生殖系統(tǒng)的分子標(biāo)志。再通過小RNA分子干擾技術(shù)，體外驗(yàn)證消減該基因表達(dá)的靶標(biāo)區(qū)域。最后將Vasa3干擾有效靶標(biāo)區(qū)域整合入表達(dá)發(fā)夾RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，用該病毒感染血吸蟲，達(dá)到能較長期抑制Vasa3基因的表達(dá)，明確該基因在血吸蟲生