利用RNA干擾技術(shù)抑制日本血吸蟲酪氨酸羥化酶的合成.pdf

1、血吸蟲病(Schistosomasis)仍然是一種流行于世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重影響人類公共健康的寄生蟲疾病,感染人數(shù)多達(dá)2億,主要流行區(qū)在70多個(gè)發(fā)展中國家。血吸蟲分為很多種類,在中國主要流行的是日本血吸蟲。
　　酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是兒茶酚胺(Catecholamine,CA)類物質(zhì)合成過程中的限速酶,TH通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程催化酪氨酸產(chǎn)生多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質(zhì),調(diào)節(jié)血吸

2、蟲蟲體肌肉的活動(dòng)度及成蟲的產(chǎn)卵率。而Sj14-3-3參與調(diào)節(jié)TH的活化過程。這些特點(diǎn)使得這兩個(gè)酶成為備受關(guān)注的藥物治療靶點(diǎn)。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi提供了一種快捷、高效的抑制特異性基因表達(dá)的技術(shù)手段,有助于研究該基因在生物模型系統(tǒng)中的作用,是研究基因功能的重要工

3、具之一。該技術(shù)已從線蟲的研究拓展到包括血吸蟲等各種生物。對于低等生物,RNA干擾始于長片段dsRNA的降解,直接轉(zhuǎn)染長片段dsRNA就可以特異抑制目的基因的表達(dá)。這種長片段的dsRNA是否能在日本血吸蟲體內(nèi)抑制目的基因的表達(dá)?抑制SjTH這種關(guān)鍵酶是否能有效影響日本血吸蟲的活力?Sj14-3-3能否通過與SjTH的相互作用影響其酶活性,干擾兒茶酚胺代謝?尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究以兒茶酚胺類合成途徑中的關(guān)鍵酶—TH和調(diào)控蛋白—1

4、4-3-3編碼基因?yàn)榘袠?biāo),采用體外轉(zhuǎn)錄長片段dsRNA分子轉(zhuǎn)染日本血吸蟲尾蚴。根據(jù)SjTH和Sj14-3-3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果,闡明長片段dsRNA對日本血吸蟲體內(nèi)基因表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上,觀察對日本血吸蟲尾蚴蟲體的活力抑制情況及其對小鼠的感染能力和感染小鼠的肝臟肉芽腫形成情況,進(jìn)一步探討SjTH和Sj14-3-3在日本血吸蟲病防治過程中的作用,為開發(fā)新的抗日本血吸蟲藥物及新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　1.長片段dsRNA在日本血吸

5、蟲體內(nèi)對目的基因的抑制：
　　RT-PCR檢測SjTH dsRNA處理的日本血吸蟲尾蚴體內(nèi)SjTH mRNA的相對表達(dá)水平,內(nèi)參基因采用SjGAPDH基因。不同組別SjTH mRNA的相對值計(jì)算用SjTH(灰度值)/GAPDH(灰度值)所得值繪成的直方圖來表示。在感染第3d和第4d后,SjTH dsRNA處理組的SjTH mRNA與對照組相比分別下降了58％和85%,與對照組相比較差異有顯著性(P<0.05);Sj14-3-3 d

6、sRNA處理組SjTH mRNA與對照組相比分別下降了30%和49%;LacZ dsRNA處理組在轉(zhuǎn)染dsRNA3d和4d后,與對照組相比差異無顯著性。
　　Sj14-3-3 dsRNA轉(zhuǎn)染后對Sj14-3-3 mRNA水平影響的規(guī)律與SjTH dsRNA對相應(yīng)mRNA的影響相似。RT-PCR檢測Sj14-3-3 dsRNA處理的日本血吸蟲尾蚴體內(nèi)Sj14-3-3 mRNA的相對表達(dá)水平,內(nèi)參基因采用SjGAPDH基因。不同組別S

7、j14-3-3 mRNA的相對值計(jì)算用Sj14-3-3(灰度值)/GAPDH(灰度值)所得值繪成的直方圖來表示。在感染第3d和第4d后,Sj14-3-3 dsRNA處理組的Sj14-3-3 mRNA與對照組相比分別下降了62%和81%;SjTH dsRNA和LacZ dsRNA處理組在轉(zhuǎn)染dsRNA3d和4d后,與對照組相比差異無顯著性。
　　Western blotting檢測各處理組對SjTH蛋白的影響,也從蛋白水平近一步驗(yàn)證

8、了RT-PCR的結(jié)果。
　　2.長鏈Sj14-3-3 dsRNA對日本血吸蟲尾蚴體內(nèi)SjTH mRNA的影響：
　　Sj14-3-3 dsRNA轉(zhuǎn)染24h和72h后,日本血吸蟲尾蚴體內(nèi)SjTH mRNA的量與空白對照組相比沒有明顯減少。但在轉(zhuǎn)染96h后,SjTH mRNA的量明顯的下降,約降低了49%,與空白組相比差異有顯著性(P<0.05)。
　　3.長鏈dsRNA抑制Sj14-3-3與SjTH后對日本血吸蟲的感染能

9、力的影響：
　　將24只小鼠隨機(jī)分成4組,每組6只。陰性對照組:正常小鼠;陽性對照組:尾蚴感染小鼠;SjTH dsRNA處理組:用SjTH dsRNA處理尾蚴1天后感染小鼠;Sj14-3-3 dsRNA處理組:用Sj14-3-3 dsRNA處理尾蚴1天后感染小鼠。感染9周后,取出小鼠的肝臟進(jìn)行病理切片,在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):陽性對照組肝臟有明顯的肉芽腫和纖維化病變, SjTH dsRNA處理組和Sj14-3-3 dsRNA組的肝臟肉

10、芽腫和纖維化病變很輕,小鼠在感染后活力沒有變化。
　　綜上多述,得出以下結(jié)論:
　　(1)體外轉(zhuǎn)錄長鏈dsRNA在日本血吸蟲尾蚴體內(nèi)能抑制目的基因的表達(dá);
　　(2)兒茶酚胺合成過程中的關(guān)鍵酶—TH和調(diào)節(jié)蛋白—14-3-3被體外轉(zhuǎn)錄長鏈dsRNA抑制后,日本血吸蟲尾蚴的活力顯著下降;
　　(3)經(jīng)dsRNA處理的尾蚴感染小鼠后,小鼠的肝臟損傷情況要明顯減輕,肉芽腫明顯減少,推測SjTH表達(dá)變化可能與血吸蟲成蟲產(chǎn)卵