不連通雙層PLGA支架負載自體骨髓間充質(zhì)干細胞與富血小板血漿的復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、一直以來，骨科學界內(nèi)普遍認為軟骨的巨大缺損難以自愈，需要進行積極治療以恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。目前，臨床現(xiàn)有的治療方法包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物注射、基于骨髓刺激技術(shù)的微骨折術(shù)和鉆孔術(shù)、自體軟骨細胞移植、骨軟骨移植術(shù)以及關(guān)節(jié)置換術(shù)等手段。這些治療方法均有各自的優(yōu)缺點和適應(yīng)癥，重建和修復(fù)后的關(guān)節(jié)軟骨與正常關(guān)節(jié)軟骨在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的差異。探索一種徹底治愈此類疾患的技術(shù)方法是當前骨科基礎(chǔ)和臨床研究的熱點和難點之一。組織工程學和再生醫(yī)學的研究不斷深入為徹

2、底治愈關(guān)節(jié)軟骨缺損和改善缺損重加后的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能提供了一個嶄新的思路。應(yīng)用胞外基質(zhì)材料、仿生材料和人工合成材料構(gòu)建支架作為種子細胞和細胞因子的載體進行體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化的組織是當前組織工程研究的重要內(nèi)容之一。由于自體或異體基質(zhì)來源的支架的取材來源相對短缺和可能帶來的疾病傳播風險問題以及生物力學性能欠佳等不足一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。人工合成的生物可降解材料具有容易獲取并對其塑性使其與缺損的形狀相匹配的優(yōu)點逐漸受到研究者的親睞。

3、已有人工合成的PLGA支架用于肌腱、韌帶、軟骨以及骨組織等缺損修復(fù)和重建的研究報道。對于關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的重建，研究者認為應(yīng)用雙層的支架進行構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨是必要的。因此，構(gòu)建雙層的的PLGA支架可能是構(gòu)建骨軟骨的一個良好選擇?？紤]到正常組織的再生和修復(fù)需要眾多細胞因子的參與和協(xié)同作用，將不同的細胞因子負載于支架可能是必要的。盡管有學者通過負載不同的重組細胞因子進行重建組織工程骨軟骨獲得了較理想的結(jié)果，但是，依然存在一些不足之處。比

4、如單一細胞因子的參與難以真正模擬組織的再生修復(fù)過程，而且在體內(nèi)降解迅速。同時，細胞因子的價格相對昂貴以及可供臨床選擇的種類依然較少等等。近年來，富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)因激活后可釋放血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor PDGF)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子（trans

5、forminggrowth factor-β TGF-β），胰島素生長因子(insulin growth factor(IGF)以及成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor b-FGF）等而廣受關(guān)注。PRP被作為自體的生長因子的重要來源，具有避免疾病傳播風險、價格低廉以及含有生長因子種類較多等有優(yōu)點。研究結(jié)果表明PRP可以提高間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells MSC)等增殖并

6、向成軟骨方向分化;PRP還可以促進軟骨下骨內(nèi)的祖細胞的遷出和成軟骨分化。體內(nèi)研究結(jié)果表明PRP聯(lián)合MSC可以促進骨組織的形成及其在骨軟骨修復(fù)中的積極作用。骨髓來源的MSC可以方便地獲取和體外擴增，且具有多向分化潛能。因此，BMSCs是構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體的較為理想的種子細胞之一。另外，通過采集新西蘭兔的自體外周血制備PRP可以獲取自體來源的多種生長因子用于誘導(dǎo)BMSCs的增殖與分化并形成成熟的骨與軟骨組織。在關(guān)節(jié)負重部位的骨軟骨缺損

7、修復(fù)中，PRP的力學支撐性能相對不足。為此，我們設(shè)計了不連通的雙層PLGA支架作為自體BMSCs和PRP的載體，將其復(fù)合體植入體內(nèi)用于骨軟骨缺損的重建與修復(fù)。本實驗中，主要探討不連通的雙層PLGA支架作為自體BMSCs和PRP的載體支架修復(fù)兔骨軟骨缺損的可行性，并觀察負載BMSCs和PRP在骨軟骨缺損重建和修復(fù)中的作用。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：不連通雙層PLGA支架負載自體富血小板血漿修復(fù)骨軟骨缺損的實驗研究。

8、r>　　 目的：明確不連通雙層PLGA支架構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體的可行性，觀察負載自體PRP在兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)中的作用。
　　 方法：⑴雙層不連通PLGA支架采用常溫模壓粒子浸出制備技術(shù)制備。材料分為三段，上段模擬軟骨段孔徑為50-100μm，孔隙率為92％，厚度為0.3 mm;中間段模擬骨軟骨交界處，是厚度為0.3 mm PLGA膜;下段模擬骨段孔徑為300-450μm，孔隙率為92％，厚度為3.4 mm。支架的各段都是分別

9、制備，最后通過二氯甲烷粘合起來，然后裁剪成直徑和高度均為4mm的圓柱形支架。將致孔劑用去離子水浸出以后，就得到研究所需的雙層支架。本研究所用支架均由復(fù)旦大學高分子材料系生物醫(yī)用材料課題組暨聚合物分子工程國家重點實驗室提供。在獲得研究所需的多孔的不連通雙層PLGA支架后，75％乙醇浸泡30min，PBS反復(fù)漂洗3次，每次5min。⑵經(jīng)新西蘭兔耳中央動脈穿刺術(shù)采集新鮮外周血10ml(含1ml3.8％的枸櫞酸鈉溶液作為抗凝劑)，在室溫條件下，

10、采用二次離心法進行制備。首次給予400g的離心力離心15min分離紅細胞和血漿，再給予800g的離心力10min分離血漿中的血小板，棄去大部分的貧血小板血漿，剩余約0.8ml液體并輕微混懸即為PRP。每次制備均在手術(shù)前完成。制備前后手工計數(shù)全血和外周血來源的PRP中的血小板濃度。實施骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓5ml進行制備骨髓來源的RPP,制備方法與過程同上。比較外周血來源的PRP與骨髓來源PRP的濃度差異。⑶將無菌的不連通雙層PLGA支架置入

11、6孔板（2例/孔），每個孔內(nèi)加入0.8ml的外周血來源的自體PRP和40μl的10％CaCl2。⑷健康新西蘭兔18只，分為三組。直徑4mm的環(huán)鉆在股骨內(nèi)髁鉆取深度4mm的新鮮缺損，將體外構(gòu)建的PLGA/PRP復(fù)合體植入缺損，對照組僅植入PLGA支架，空白組缺損處不植入材料。術(shù)后4周和12周進行大體觀察、組織學、免疫組化、q-PCR檢測相關(guān)基因表達和Micro-CT掃描觀察等。
　　 結(jié)果：獲取了具有不同孔徑的不連通雙層PLGA支

12、架，制備的PRP中的血小板濃度為全血中的4.9倍，骨髓來源PRP的濃度為外周血來源PRP濃度的1.41倍。在術(shù)后4周和12周，PLGA/PRP組的大體評分和組織學評分均高于PLGA組和空白缺損組(P＜0.05)。12周時，PLGA/PRP組內(nèi)的Ⅱ型膠原和aggrecan的相對表達水平明顯高于PLGA組和空白缺損組(P＜0.05);Micro-CT掃描可見PLGA/PRP組的軟骨下骨缺損區(qū)域有礦化組織存在較多。
　　 結(jié)論：在新西

13、蘭兔骨軟骨缺損修復(fù)模型中，不連通雙層PLGA支架可以用于骨軟骨缺損的修復(fù)，負載PRP促進了軟骨缺損的修復(fù)以及軟骨下骨缺損內(nèi)礦化組織的形成。
　　 第二部分：不連通雙層PLGA支架負載自體BMSCs與PRP修復(fù)骨軟骨缺損的實驗研究。
　　 目的：觀察不連通雙層PLGA支架負載自體BMSCs和PRP在兔骨軟骨缺損修復(fù)中的作用。
　　 方法：⑴于新西蘭兔髂后上棘行骨髓穿刺術(shù)抽取3-4ml骨髓，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進行體

14、外擴增培養(yǎng)，選用第三代(P3)的自體BMSCs進行體內(nèi)植入研究。⑵將培養(yǎng)至第三代的BMSCs制備成濃度為4.0×106/ml和4×105/ml的細胞懸液各1ml，使用自制的細胞接種離心管，采用分次離心的方法將BMSCs接種至雙層的PLGA支架的軟骨層和骨層。接種前后使用細胞計數(shù)板鏡下手工計數(shù)懸液中接種前后的細胞數(shù)量計算接種的效率。將支架-細胞復(fù)合體轉(zhuǎn)移至6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，電鏡掃描觀察細胞在PLGA支架上的粘附。⑶按照上述方法制備新西蘭兔的

15、自體PRP,將PLGA/BMSCs復(fù)合體轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)（2例/孔），加入0.8ml自體PRP與40μl的10％CaCl2。
　　 4.新西蘭兔股骨內(nèi)髁骨軟骨缺損模型制備與PLGA/BMSCs/PRP復(fù)合體植入健康成年新西蘭兔16只，分為4組。按照上述的骨軟骨缺損制備直徑和深度4mm的缺損，實驗組植入PLGA/BMSCs/PRP，對照組分別植入PLGA/PRP和PLGA，空白組缺損處不植入任何材料。于術(shù)后6個月進行大體外觀評估、組

16、織學評估、免疫組化染色觀察、q-PCR檢測相關(guān)基因表達水平以及micro-CT掃描和定量評估軟骨下骨缺損區(qū)域的BV/TV值。
　　 結(jié)果：骨髓穿刺獲取骨髓貼壁培養(yǎng)可以獲取自體的BMSCs，電鏡觀察表明分次離心接種法可以將不同濃度的BMSCs接種于PLGA支架的軟骨層和骨層并粘附與支架。骨層和軟骨層的接種效率分別為（81.47±2.53）％和（85.27±1.79）。術(shù)后6個月，PLGA/BMSCs/PRP組的大體評分和組織學評分

17、均高于PLGA組和空白缺損組(P＜0.05)，PLGA/BMSCs/PRP組與PLGA/PRP組的大體評分間無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05);Ⅱ型膠原和aggrecan在PLGA/BMSCs/PRP組的相對表達水平均高于PLGA組和空白缺損組(P＜0.05)，在PLGA/BMSCs/PRP組和PLGA/PRP組的表達水平無明顯差異(P＞0.05);新生骨組織在缺損處所用組織內(nèi)的百分比即（BV/TV），PLGA/BMSCs/PRP組的BV