中醫(yī)圓道理論指導下模擬微重力對骨髓間充質(zhì)干細胞分化潛能的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞在組織生物工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域有著巨大的應用潛力。然而有很多問題尚未解決，比如干細胞分化的效率，種子細胞的數(shù)量以及干細胞恰當?shù)囊浦卜椒ǖ取τ诟杉毎姆只?，主要誘導方法是采用基因重編碼或是化學特殊誘導因子，盡管這些方法可以成功實現(xiàn)誘導，但是他們所引起的致瘤性及過度分化等問題一直受到研究者的關(guān)心。如果能從干細胞本身著手，大大提高干細胞的分化潛能，這將有望有效的提高干細胞的誘導效率，但是目前尚無特異性提高干細胞自身分化潛能的有

2、效手段。
　　在過去40年中，太空航天事業(yè)的發(fā)展讓人們認識到微重力對生物有著重大的影響。其中包括腦脊液流動改變，體液電解質(zhì)喪失，肌肉萎縮，免疫系統(tǒng)功能下降等。同樣,微重力會改變細胞的一些性質(zhì)，包括細胞的形態(tài)功能和細胞對環(huán)境的反應。我們的研究發(fā)現(xiàn)微重力干預后MSCs細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)轭悎A形。―形者神之質(zhì)，神者形之用‖，形態(tài)的改變必然導致其功能的變化。在中醫(yī)圓道理論指導下，我們認為細胞圓形的改變正是一種原始狀態(tài)的回歸

3、。圓形的骨髓間充質(zhì)干細胞是否具有更高的分化潛能。本研究采用地面回轉(zhuǎn)培養(yǎng)器（2D-clinostat）模擬細胞在空間中的受力情況，以地面正常1g重力（Normalgravity,NG）作為對照，研究模擬微重力（simulatedmicrogravity,SMG）干預后骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化以及向內(nèi)皮細胞分化的能力，同時探討微重力通過對細胞骨架以及關(guān)鍵分子RhoA活性的動態(tài)調(diào)節(jié)，從而指導干細胞向不同方向分化的機制。本研究首次提出細胞

4、形態(tài)對于干細胞誘導效率有重大意義，并依據(jù)中醫(yī)―圓道‖觀提出SMG刺激來提高干細胞誘導的新策略，有望實現(xiàn)干細胞高效率高安全性的誘導，為干細胞廣泛安全的運用于臨床提供新的思路。
　　實驗一模擬微重力干預促進MSCs向神經(jīng)細胞分化
　　目的：觀察SMG致骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、凋亡及多潛能指標的改變，并對SMG作用后MSCs向神經(jīng)細胞分化效率進行評價。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，流式細胞術(shù)進行鑒定，實驗隨機分為2

5、D-clinostat干預的SMG培養(yǎng)組與NG對照培養(yǎng)組；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)分析凋亡，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測多潛能標志OCT4表達的變化，激光共聚焦、流式細胞術(shù)、real-timePCR觀察誘導后神經(jīng)樣細胞MAP-2、CHAT、TH的表達，ELISA及real-timePCR檢測細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子表達水平，同時應用膜片鉗技術(shù)檢測誘導后神經(jīng)元動作電位變化。
　　結(jié)果：①MSCs的培養(yǎng)與鑒定：所培養(yǎng)的MSCs細胞經(jīng)流式細胞術(shù)

6、鑒定，表達CD9097.37％和CD4494.35％，表達CD45陰性。②SMG72小時左右后細胞形態(tài)及凋亡變化：通過r值（細胞長軸和短軸的比值）反應細胞變圓程度，采用MetaMorph7.1software分析SMG組細胞明顯趨于圓形（p<0.05）。流式細胞術(shù)檢測未發(fā)現(xiàn)有凋亡。③細胞多潛能標志物OCT4表達：微重力干預24小時后OCT4的表達明顯升高（p<0.05）。隨著干預時間延長其表達變化不明顯。④誘導的神經(jīng)細胞MAP-2/CH

7、AT/TH表達：a.PCR檢測微重力干預后分化的神經(jīng)樣細胞表達更高MAP-2，CHAT,TH水平。對于MAP-2的表達，在分化7天和14天表達水平約是正常重力組兩倍（p<0.05）；對于TH的表達，在分化14天時表達水平增高約1.5倍（p<0.05）；對于CHAT的表達，在分化7天時表達水平是正常重力組1.7倍（p<0.05）。b.流式細胞術(shù)檢測表達MAP-2,CHAT,TH陽性細胞數(shù)：微重力干預組明顯高于正常重力組。微重力組MAP-2

8、陽性細胞數(shù)48.03％±2.33％，正常重力組37.22％±1.98％；微重力組TH陽性細胞數(shù)17.45％±1.26％，正常重力組14.06±1.95％；微重力組CHAT陽性細胞數(shù)5.53％±1.32％，正常重力組2.96％±1.58％。⑤神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達：在誘導前，微重力明顯提高MSCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度。其中BDNF濃度比正常重力組增加了100％，（p<0.05）,CNTF濃度增加了85％（p<0.05）。在分化7天后，CNT

9、F濃度比正常重力組提高了50％（p<0.05）,其他未見有明顯差異。同時MSCs在分化前比分化后分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度更高。PCR進一步證實了結(jié)果。⑥動作電位：微重力干預后MSCs分化的神經(jīng)樣細胞表現(xiàn)為更具成熟特性的動作電位特征。微重力組細胞動作電位幅度及頻次明顯高于正常重力組。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的分化能力更高。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的分化能力更高。

10、>　　實驗二模擬微重力干預促進MSCs向內(nèi)皮細胞分化
　　目的：對SMG作用后MSCs向內(nèi)皮細胞分化效率進行評價。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，實驗隨機分為2D-clinostat干預的SMG培養(yǎng)組與NG對照培養(yǎng)組；免疫熒光及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測誘導后細胞表達vWF、Flk-1量，采用DiI-Ac-LDL吞噬實驗及體外血管成形實驗的試劑盒檢測兩組誘導后內(nèi)皮細胞的功能差異。
　　結(jié)果：①免疫熒光檢測：以分化前MS

11、Cs為空白對照，微重力干預組內(nèi)皮樣細胞表達vWF和Flk-1量明顯高于正常重力組。分化前MSCs未見表達vWF和Flk-1。②反轉(zhuǎn)錄PCR:微重力干預后的MSCs分化為內(nèi)皮樣細胞表達vWF水平是正常重力組的2.8倍（p<0.05）；表達Flk-1水平是正常重力組的1.6倍（p<0.05）。微重力處理明顯促進MSCs向內(nèi)皮細胞的分化。③DiI-Ac-LDL吞噬實驗：兩組分化后的內(nèi)皮細胞都具有攝取脂質(zhì)的能力，兩組間未見有明顯差異。然而對于未

12、分化的MSCs兩組都未見有攝取現(xiàn)象。④體外血管成形實驗：softwareImageJ分析軟件分析成管面積,成管長度差異。分化6天后微重力組成環(huán)面積和長度都明顯高于正常重力組（p<0.05）。
　　結(jié)論：SMG作用下圓形的骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞的分化能力更高。
　　實驗三細胞骨架和RhoA共同調(diào)節(jié)微重力對MSCs分化的影響
　　目的：觀察不同時間段微重力作用對細胞骨架和RhoA活性的變化，初步探討其影響MSCs向不同

13、方向分化的機制。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，實驗隨機分為短時間干預SMG72h組、長時間干預SMG10d組與NG對照培養(yǎng)組；激光共聚焦檢測細胞骨架α-actin、Microtubules變化。將不同組細胞向神經(jīng)方向，內(nèi)皮方向、成脂方向、成骨方向誘導分化10天，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測不同組分化的效率。RhoGTPasepull-downAssay檢測不同組RhoA的活性變化。RhoA活性阻滯劑ExoenzymeC3Trans

14、ferase干預后檢測MSCs分化能力的變化。
　　結(jié)果：①鬼筆環(huán)肽對不同組MSCs細胞骨架α-actin的標記。短時間微重力處理細胞骨架張力下降，表達減低。隨著時間延長，微重力處理10天后微絲表達有所恢復，骨架張力升高。②β-tubulin對不同組MSCs細胞骨架微管蛋白的標記。短時間微重力處理微管崩解，模糊不清，表達減低。隨著時間延長，微重力處理10天后微管有所聚集，微管蛋白表達有所恢復。③向內(nèi)皮誘導：SMG72h誘導的細胞表

15、達vWF水平增高，是正常重力組的1.6倍（p<0.05），然而當微重力處理時間為10天后，誘導的細胞表達vWF水平明顯下降。④向神經(jīng)方向誘導：SMG72h誘導的細胞表達MAP-2水平增高，是正常重力組的2倍（p<0.05），SMG10天后，MAP-2水平明顯下降，基本和正常重力組表達水平一致，同SMG72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑤向成骨誘導：SMG72hALP水平減低，約是正常重力組的0.6倍（p<0.05），然而當SMG1

16、0天后，誘導的細胞表達ALP水平明顯增加，同微重力72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑥向成脂誘導：SMG72h組表達PPARγ2水平明顯增加，約是正常重力組的1.6倍（p<0.05），然而SMG10天后，誘導的細胞表達PPARγ2水平明顯下降，同SMG72h組比較，差異顯著（p<0.05）。⑦總RhoA表達量在干預各組沒有明顯變化，然而活化RhoA的表達量SMG72h組明顯下降，與正常重力組相比下降約80％（p<0.05）；但是S

17、MG10天后RhoA的活性顯著回升，與72h處理組相比高出約10倍，與正常重力組相比表達水平升高約60％（p<0.05）。⑧RhoA阻滯劑干預后，SMG10d組分化的能力被逆轉(zhuǎn)，成骨方向分化能力明顯下降，ALP表達下降80％（p<0.05）；成脂方向分化能力增加，PPARγ2表達水平提高約3倍（p<0.05）。
　　結(jié)論：微重力不同作用時間對細胞骨架張力的改變和微管的聚散很可能是通過RhoA調(diào)節(jié)作用。當短時間干預MSCs，降低了R