MMT誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及燈盞乙素的保護(hù)作用研究.pdf

1、甲基環(huán)戊二烯羰基錳（methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl，MMT）是一種汽車燃油添加劑，可以提高燃油的品質(zhì)，降低成本。1995年，美國環(huán)境保護(hù)署批準(zhǔn)MMT可作為汽油抗爆劑替代四乙基鉛用于無鉛汽油。隨著無鉛汽油在全世界范圍內(nèi)的廣泛使用，新型汽油防爆劑MMT的人體毒性逐步得到重視。目前研究表明，MMT存在一定的神經(jīng)毒性，因此，有必要深入研究MMT的神經(jīng)毒性機(jī)制并尋找相應(yīng)的防治藥物。SK-N

2、-SH細(xì)胞作為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，被廣泛用于人神經(jīng)細(xì)胞增殖、發(fā)育、凋亡等方面的實驗。燈盞乙素是燈盞花的主要有效成分，為黃岑素苷小分子結(jié)構(gòu)。近年研究表明，燈盞乙素對老年癡呆癥有治療作用，提示燈盞乙素具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實驗利用體外培養(yǎng)的SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞模型研究MMT的神經(jīng)毒性作用及分子機(jī)制以及燈盞乙素的體外保護(hù)作用。本研究分為兩個部分：
　　 實驗一：MMT誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究。利用MMT誘導(dǎo)SK-N-

3、SH細(xì)胞后，MTT法檢測細(xì)胞存活率，分光光度法檢測活性氧(ROS)生成，化學(xué)發(fā)光法檢測Caspase-3活性，Western blot法檢測p38 MAPK磷酸化程度。結(jié)果顯示，1.0mmol/LMMT誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞4，8，12，24，36，48h后，細(xì)胞存活率明顯下降并與誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)(P＜0.01)；同時0.2，0.5，1.0，1.5，2mmol/L的MMT分別誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞24h后也導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降并與誘導(dǎo)濃度

4、呈正相關(guān)(P＜0.01)。1.0mmol/L MMT誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞24h后，細(xì)胞ROS生成量為正常組的5.2倍(P＜0.01)；抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)及二硫蘇糖醇(DTT)可有效抑制細(xì)胞ROS生成(P＜0.01)，提高細(xì)胞存活率(P＜0.01)；在這一過程中，Capase-3活性明顯增強(qiáng)，為對照組的3.01倍(P＜0.01)；同時p38 MAPK磷酸化程度加強(qiáng)；p38 MAPK特異性抑制劑SB203580可提高細(xì)胞存

5、活率(P＜0.05)，抑制Caspase-3的活性(P＜0.01)。結(jié)論：MMT誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡與ROS升高，激活Caspase-3有關(guān)，這一過程有p38 MAPK相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與。
　　 實驗二：燈盞乙素對MMT誘導(dǎo)SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究。將SK-N-SH細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常組，MMT誘導(dǎo)組，1.2×10-1mg/L燈盞乙素組，3.0×10-2mg/L燈盞乙素組，7.5×10-3mg/L燈盞

6、乙素組。燈盞乙素預(yù)保護(hù)2h，1mmol/L MMT誘導(dǎo)24h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率，分光光度法檢測細(xì)胞ROS生成、細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)產(chǎn)量，化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)釋放量及Caspase-3活性變化。結(jié)果顯示，燈盞乙素預(yù)保護(hù)的細(xì)胞在MMT誘導(dǎo)后，與MMT誘導(dǎo)組相比，細(xì)胞存活率上升(P＜0.05)，細(xì)胞ROS生成量受到抑制(P＜0.01)；細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)SOD活性增高(P＜