K-ATP通道抵制劑格列本脲對FE2+引起的SK-N-SH細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、K - A T P 通道抑制劑格列本脲對F e 2 + 引起的S K ．N ．S H 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究摘要帕金森病( P a r k i n s o n ’S d i s e a s e ，P D ) 是一種繼阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，P D 主要病變部位在黑質(zhì)( s u b s t a n t i an i g r a ，S N ) 、紋狀體和蒼白球等部位，最主要的病理學(xué)特征為黑質(zhì)致密帶( s u b s t

2、a n t i a n i g r a z o n ac o m p a c t a 。S N Z C ) 多巴胺( d o p a m i n e ，D A ) 能神經(jīng)元脫失及伴發(fā)的紋狀體軸突末梢D A 的耗竭。有研究表明P D 病人黑質(zhì)D A 能神經(jīng)元的選擇性損傷與黑質(zhì)區(qū)D A 細(xì)胞A T P 敏感性鉀通道( A T P —s e n s i t i r ep o t a s s i u mc h a n n e l s ，K -

3、A T P ) 的激活有關(guān)。K - A T P 通道激活可導(dǎo)致細(xì)胞膜的超極化和線粒體功能障礙。大量文獻(xiàn)報(bào)道，在P D 病人S N 內(nèi)存在著鐵的聚積，并且在M P T P 誘導(dǎo)的小鼠P D 模型中得到了同樣的結(jié)論。鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵性作用，過多的鐵聚積，可造成細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S ) 增多和A T P 的生成減少，進(jìn)而激活K -

4、 A T P 通道。研究發(fā)現(xiàn)二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l ( d i v a l e n tm e t a l t r a n s p o r tl ，D M T I ) 參與D A 能神經(jīng)元鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，且其過度表達(dá)與腦鐵異常增高有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞膜的超極化可增強(qiáng)D M T l的攝鐵功能。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用K —A T P 通道抑制劑格列本脲對D A 能S K - N - S H 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察其在F e 2 + 引起的D A 能S K —

5、N - S H 細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為正常對照組、F e 2 + 損傷組和格列本脲保護(hù)組，應(yīng)用乳酸脫氫酶( L D H ) 測試法、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀( F C M ) 、w e s t e r nb l o t s 等技術(shù)方法觀察各組間細(xì)胞的L D H 釋放量、攝鐵功能、線粒體膜電位和超氧化物歧化酶( S O D ) 等指標(biāo)的變化情況。結(jié)果如下：1 ．與正常組比較，F(xiàn) e 2 + 處理組細(xì)

6、胞釋放的L D H 量明顯增多( P < 0 ．0 1 ) ，而格列本脲預(yù)處理組( 濃度為5 P m o l ／L 和l O l a m o l ／L ) 與F e 2 + 處理組比較，其L D H 釋放量明顯減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 尸< O ．0 1 ) 。2 ．應(yīng)用熒光染料結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測細(xì)胞的攝鐵功能。結(jié)果顯示格列本脲預(yù)處理組與F e 2 + 處理組比較，其攝鐵功能明顯減弱，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 雙因素

7、方差分析，F(xiàn) = 2 4 ．8 8 5 ，P < O ．0 1 ，F(xiàn) e 2 + V S ．對照組；P < O ．0 1 ，格列本脲組V S ．F e 2 +組) 。3 ．F C M 檢測線粒體膜電位( 4 ％夕顯示，F(xiàn) e 2 + 處理組細(xì)胞的A 蚴較對照組明顯降低，而5 P m o l ／L 和l O l a m o l ／L 格列本脲預(yù)處理后則可明顯抑制F e 2 + 造成的4g X m的降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 尸&

8、lt; O ．0 1 ) 。T h e p r o t e c t i v ee f f e c t o f K - A T P c h a n n e l b l o c k e rg l y b e n c l a m i d e a g a i n s tF e 2 + ．i n d u c e dc e l lt o x i c i t yi nd o p a m i n e r g i c S K - N ．S H c e I

9、 IA b s t r a c tP a r k i n s o n ’S d i s e a s e ( P D ) i s t h e s e c o n d l y m o s t p r e v a l e n tn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e j u s ta f t e rA l z h e i m e r ’Sd i s e a s e ．N e u r o p

10、 a t h o l o g i c a lh a l l m a r k so f t h ed i s e a s ei n c l u d et h ed e g e n e r a t i o na n d l o s so f d o p a m i n e r g i cn e u r o n s i nt h es u b s t a n t i an i g r ap a r sc o m p a c t a ( S N

11、 p c ) a n dt h e s u b s e q u e n td o p a m i n e ( D A ) d e p l e t i o n i nt h es t r i a t u m ．A T P - s e n s i t i v ep o t a s s i u m ( K - A T P )c h a n n e l s h a v eb e e n i m p l i c a t e d t o t h e

12、 s e l e c t i v e D A n e u r o n s d a m a g e i ns u b s t a n t i an i g r a ( S N ) b u t n o ti n t h e n e i g h b o r i n gv e n t r a l t e g m e n t a la r e a( V T A ) ．T h ea c t i v a t i o n o f K —A T P c

13、h a n n e l sm a y r e s u l ti nh y p e r p o l a r i z a t i o n o fc e l l m e m b r a n ep o t e n t i a l a n dm i t o c h o n d r i a lf u n c t i o nd a m a g e ．A l s oi t W a sr e p o r t e d t h a tt h e r e w

14、a s a n a c c u m u l a t i o no f i r o ni n t h eS N o f P D p a t i e n t s ．T h ei r o np l a y sak e y r o l ei no x i d a t i v es t r e s s ，a n dt h e a c c u m u l a t i o no f i r o nm a yi n d u c et h ei n c

15、r e a s eo f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( R O S ) a n dt h ed e c r e a s eo fa d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( A T P ) w h i c h c o u l ds u b s e q u e n t l y a c t i v a t e K ．A T Pc h a n n e

16、 l s ．S t u d i e ss h o w e d t h a td i v a l e n tm e t a l t r a n s p o r t1 ( D M T l ) i s r e l a t e d t ot h e a c c u m u l a t i o n o fi r o n i n S Na r e a o fP Dp a t i e n t s a n dc e l l m e m b r a n

17、eh y p e r p o l a r i z a t i o nm a y e n h a n c e i t si r o n —t r a n s p o r t i n gf u n c t i o n ．I n o u rs t u d y ,l a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y , f l o w c y t o m e t r y , w e