維甲酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞分化過程中核基質(zhì)蛋白的變化研究.pdf

1、本論文以維甲酸( retinoic acid，RA)處理人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞，鑒定RA對人神經(jīng)母細胞瘤細胞的終末分化誘導(dǎo)效果。在此基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析、免疫細胞化學(xué)、細胞分子生物學(xué)等技術(shù)，對在SK-N-SH細胞誘導(dǎo)分化過程中核基質(zhì)蛋白的變化進行了較為系統(tǒng)的研究。分析鑒定和確證了與神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖分化相關(guān)的特異核基質(zhì)蛋白，并研究特異核基質(zhì)蛋白與人神經(jīng)母細胞瘤細胞相關(guān)癌基因、抑癌基因在細胞內(nèi)的共定位關(guān)系與變化

2、，探索它們在神經(jīng)母細胞瘤細胞誘導(dǎo)分化過程中的調(diào)控作用，以期能夠在較為整體水平上進一步認(rèn)識神經(jīng)母細胞瘤細胞癌變與逆轉(zhuǎn)機理問題，從而找出神經(jīng)細胞增殖與分化相關(guān)的靶向性蛋白。 實驗結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L RA處理之后，人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞的增殖受到抑制，細胞生長抑制率達57.93％，細胞發(fā)生了Go/Gi期阻滯。光鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L RA處理后的SK-N-SH細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生恢復(fù)性變化，細胞呈極

3、性狀、伸出多個軸突樹突狀突起、細胞逐漸變小變圓并融合在一起形成類似神經(jīng)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)核質(zhì)比例減小，細胞體積減小，細胞表面微絨毛減少，細胞核形態(tài)趨于規(guī)則、核仁數(shù)目減少，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)減少、常染色質(zhì)增多，細胞內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多、高爾基體結(jié)構(gòu)更為典型等變化；免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)RA誘導(dǎo)處理后，SK-N-SH細胞內(nèi)癌基因c-myc、c-fos表達產(chǎn)物減少，抑癌基因p53、p27表達產(chǎn)物增多；同時，RA能夠促進SK-N-SH細胞

4、的神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE、Synaptophysin、MAP2的表達。選擇性抽提整裝光鏡和電鏡觀察顯示，經(jīng)RA處理的SK-N-SH細胞核基質(zhì)纖維和中間纖維數(shù)量和層次更加豐富，分布更為均勻，單絲成份增多，與核纖層聯(lián)系更為緊密，形成貫穿整個核質(zhì)區(qū)域的較為規(guī)則的纖維網(wǎng)絡(luò)。雙向凝膠電泳與MALDI-TOF質(zhì)譜分析共鑒定出41個在RA誘導(dǎo)分化前后表達差異的核基質(zhì)蛋白，其中在分化的SK-N-SH細胞中表達上調(diào)的蛋白點為：Vimentin、MTMR

5、2、SUMO-3等；表達下調(diào)的蛋白為TRPV2、Nucleophosmin、Prohibitin等；處理后消失的蛋白為ATP synthase beta chain、PSB3;處理后新出現(xiàn)的蛋白為LGII、SYCEI。蛋白質(zhì)印跡雜交與免疫熒光顯微鏡觀察確證了Nucleophosmin(NPM)、Prohibitin(PHB)、Vimentin和hnRNP A2/BI在SK-N-SH細胞分化過程中的表達變化及其在核基質(zhì)上的定位。激光共聚焦

6、顯微鏡觀察顯示NPM、PHB和hnRNP A2/B1與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)均存在一定的共定位關(guān)系，并且它們的表達水平和細胞定位在誘導(dǎo)分化前后均發(fā)生了改變。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果還顯示NSE、SYP和MAP2與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)也存在一定的共定位關(guān)系，它們的表達水平和細胞定位在誘導(dǎo)分化前后也發(fā)生了變化。 研究結(jié)果表明，1μmol/L R

7、A能有效抑制人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞的增殖活動，改變SK-N-SH細胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征，下調(diào)癌基因c-myc、c-fos和上調(diào)抑癌基因p53、p27等的表達，從而對人神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化具有顯著誘導(dǎo)效果。在SK-N-SH細胞分化過程中，其核基質(zhì).中間纖維系統(tǒng)構(gòu)型產(chǎn)生了與正常細胞相似的恢復(fù)性變化，并且出現(xiàn)了多種差異表達的核基質(zhì)蛋白，其中NPM、PHB、Vimentin和hnRNP A2/B1為不同誘導(dǎo)分化物誘導(dǎo)多種腫瘤細胞分化

8、后出現(xiàn)的共同差異核基質(zhì)蛋白。而功能性共同差異核基質(zhì)蛋白NPM、PHB、hnRNP A2/B1和神經(jīng)元特異表達標(biāo)志物NSE、SYP、MAP2與c-Myc、c-Fos、P53、Rb等均存在共定位關(guān)系并在SK-N-SH細胞分化過程中出現(xiàn)分布和位移變化的現(xiàn)象。由此證實了RA能夠干預(yù)SK-N-SH細胞相關(guān)癌基因、抑癌基因的活性，改變一些與基因表達調(diào)控和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的重要核基質(zhì)蛋白的表達，進而阻滯細胞周期，促使人神經(jīng)母細胞瘤細胞分化。這為我們在