金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ在七氟烷預(yù)處理大鼠海馬神經(jīng)元延遲性保護(hù)中的功能.pdf

1、第一章七氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠肝、腦及心臟基因表達(dá)譜的影響
　　目的:利用DNA芯片方法探討七氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟、腦及心臟基因表達(dá)譜的影響。方法:七氟烷預(yù)處理大鼠后，DNA微陣列法檢測(cè)大鼠肝、腦及心臟基因表達(dá)差異，qRT-PCR驗(yàn)證其中三個(gè)差異表達(dá)的基因。結(jié)果:根據(jù)事先制定的數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)，2％的七氟烷預(yù)處理90分鐘后，所有組織表現(xiàn)出基因表達(dá)差異。在這些表達(dá)差異的基因里有34個(gè)基因在至少兩個(gè)組織中呈現(xiàn)同一方向的表達(dá)變化，其中19個(gè)上升，

2、15個(gè)下降。本研究選取了三個(gè)在肝臟中表達(dá)有影響的三個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DNA微陣列結(jié)果一致。結(jié)論:鑒別了34種在大鼠肝腦心臟經(jīng)七氟烷預(yù)處理后表達(dá)差異的基因。
　　第二章金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ在七氟烷預(yù)處理原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元過(guò)程中的作用
　　目的:探討七氟烷延遲預(yù)處理在大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元中的保護(hù)特性及金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ(Metallothionein，MT-Ⅰ+Ⅱ)在麻醉延遲預(yù)處理介導(dǎo)的保護(hù)作用中的

3、作用機(jī)制。
　　方法:1）原代神經(jīng)元培養(yǎng);2）七氟烷預(yù)處理;3）建立體外氧一葡萄糖剝奪模型;4)qRT-PCR檢測(cè)MT-Ⅰ+Ⅱ mRNA表達(dá)水平;5）乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)神經(jīng)元毒性;6）微管相關(guān)蛋白-2/膠質(zhì)纖維酸性蛋白檢測(cè)神經(jīng)元毒性;7）免疫熒光檢測(cè)MTⅠ+Ⅱ的神經(jīng)元中的定位情況;8)siRNA抑制MTⅠ+Ⅱ的表達(dá);9）外源MTⅠ+Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)果:1）1.5％七氟烷預(yù)處理3小時(shí)組缺糖缺氧后(Oxygen-Glu

4、eose Deprivation OGD)在任一時(shí)間點(diǎn)對(duì)神經(jīng)元毒性明顯小于沒(méi)有預(yù)處理組(P＜0.05)。七氟烷預(yù)處理對(duì)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用在24小時(shí)時(shí)是11.7±8.2％(n=22);保護(hù)作用在72小時(shí)時(shí)達(dá)到頂峰37.5％±4.3％(n=22);在96小時(shí)時(shí)保護(hù)作用仍然有31.9％±5.2％;n=29）。2）OGD3小時(shí)對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)都有毒性作用，但是神經(jīng)元的毒性作用更大，其生存率是39.6±7.8％，而神經(jīng)膠質(zhì)在OGD

5、3h后生存率是80.2±10.5％。但是七氟烷預(yù)處理組，神經(jīng)元存活率恢復(fù)至85.3±9.2％，存活率上升程度超過(guò)125％，而神經(jīng)膠質(zhì)存活率上升程度只有22％。對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行兩因素方差分析表明，OGD和七氟烷預(yù)處理(APC)的主效應(yīng)顯著(P＜0.01)，且交互作用顯著(P＜0.01)。方差分析表明七氟烷預(yù)處理能夠有效抵抗OGD介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡作用，OGD組和APC+OGD組兩組間T檢驗(yàn)也有差異，P＜0.01，也能證實(shí)這一結(jié)果。神經(jīng)膠質(zhì)的兩因

6、素方差分析結(jié)果則發(fā)現(xiàn)OGD和七氟烷預(yù)處理的主效應(yīng)顯著(P＜0.05)，但兩組間交互作用無(wú)差異(P=0.53)，這說(shuō)明七氟烷預(yù)處理不能保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)拮抗OGD介導(dǎo)的損傷作用。3）外源性MTⅠ+Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元后，3小時(shí)OGD處理，LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組相比（轉(zhuǎn)染胰島素氧化β鏈），MTⅠ+Ⅱ?qū)D誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用從3.1±1.4％(轉(zhuǎn)染1.6μM MTⅠ+Ⅱ，P＞0.05，n=10)上升至34.8±9.2％(轉(zhuǎn)染3

7、.2μM MTⅠ+Ⅱ,P＜0.001,n=10)。4) MTImRNA表達(dá)水平在預(yù)處理12小時(shí)后達(dá)到峰值，為未處理組的2.2±0.8倍，在預(yù)處理后6、12小時(shí)與未處理組表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);MTⅡ mRNA表達(dá)水平在預(yù)處理12小時(shí)后達(dá)到峰值，為未處理組的2.9±1.1倍，在預(yù)處理后3、6、12小時(shí)與未處理組表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。5)無(wú)義siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)七氟烷預(yù)處理保護(hù)原代神經(jīng)元作用影響不大，為19.4±3.5％。

8、兩因素方差分析表明，MTⅠ+Ⅱ基因沉默(P＜0.05)和七氟烷預(yù)處理(P＜0.01)主效應(yīng)顯著，但兩者間交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.564)，這表明部分抑制MTⅠ+Ⅱ基因表達(dá)并不能有效降低七氟烷預(yù)處理拮抗OGD介導(dǎo)神經(jīng)元損傷作用。但是在未預(yù)處理對(duì)照組，與轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA相比，轉(zhuǎn)染MT-Ⅰ+Ⅱ siRNA顯著加重了OGD處理對(duì)神經(jīng)元的損傷作用，這表明細(xì)胞MT-Ⅰ+Ⅱ水平低于正常水平時(shí)，OGD更加容易引起神經(jīng)元損傷。6)與源自未經(jīng)預(yù)處理

9、的鼠原代神經(jīng)元相比，源自經(jīng)預(yù)處理的大鼠原代神經(jīng)元能夠有效對(duì)抗OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷(22.5±3.4％; n=16，P＜0.05)。7)單克隆MTⅠ+Ⅱ主要分布于MAP2標(biāo)記的神經(jīng)元。
　　結(jié)論:1）建立經(jīng)七氟烷處理后金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ時(shí)間變化表。2）在麻醉劑延遲預(yù)處理過(guò)程中，神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞都得到保護(hù)。3）神經(jīng)元既能容易遭受葡萄糖剝奪引起的損傷，這一損傷作用又更容易受到缺血預(yù)處理作用的保護(hù)。4）基因敲除研究表明金屬硫蛋白參

10、與了七氟烷介導(dǎo)的延遲預(yù)處理過(guò)程。5）直接轉(zhuǎn)染外源性金屬硫蛋白，表明金屬硫蛋白是預(yù)防缺血性損傷的有效手段。
　　第三章金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ作為氧化應(yīng)激傳感器在七氟烷預(yù)處理保護(hù)過(guò)程中的作用機(jī)制
　　目的:探討了經(jīng)吸入麻醉劑七氟烷、活性氮類一氧化氮及超氧化自由基預(yù)處理之后，金屬硫蛋白作為氧化應(yīng)激傳感器發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法:1）原代神經(jīng)元培養(yǎng);2）七氟烷預(yù)處理;3）體外氧—葡萄糖剝奪模型的建立;4）乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)神

11、經(jīng)元毒性;5）神經(jīng)元核蛋白提取;6）Western blot檢測(cè)MTF-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:1）200μM SNAP預(yù)處理能夠顯著提高神經(jīng)元拮抗OGD損傷，保護(hù)率為（38.2±2.9％;n=28），與未經(jīng)預(yù)處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001;n=28)。同樣濃度的SNAP經(jīng)37℃，24小時(shí)降解處理后再預(yù)處理神經(jīng)元，結(jié)果表明SNAP降解后，保護(hù)率顯著降低只有7.9±4.1％(n=14)，與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.4)，與未

12、降解SNAP有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01;n=14)。巴拉刈(yi)預(yù)處理能夠顯著提高神經(jīng)元拮抗OGD損傷，保護(hù)率為（23.8±6.2％;n=14），與未經(jīng)預(yù)處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01;n=14)。為了確保拮抗OGD損傷的保護(hù)作用只是來(lái)自相應(yīng)的預(yù)處理，在OGD處理評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)前，更換神經(jīng)元培養(yǎng)基。LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SNAP、巴拉刈及降解型SNAP與正常對(duì)照組相比，LDH水平差異不大，分別是正常組的(75.2±2.6％，p=0

13、.18，n=6)、(82±3.1％; p=0.26，n=6)及(65.5±1.1％;p＜0.05; n=6)。SNAP、巴拉刈預(yù)處理后2小時(shí)，與未預(yù)處理組相比，MTF-1核定位分別提高了74±18％和224±85％;n=3，），而降解型SNAP預(yù)處理對(duì)提高M(jìn)TF-1核定位程度不明顯，只有16±5.8％;n=3，)。2)與未預(yù)處理相比，2.5％七氟烷預(yù)處理2小時(shí)對(duì)神經(jīng)元拮抗4小時(shí)OGD處理?yè)p傷作用的保護(hù)率為(31.6±3.4％;p＜0.0

14、01;n=15)。在七氟烷預(yù)處理前，用0.1mM誘導(dǎo)性一氧化氮抑制劑氨基胍（aminoguanidine，AG）或者1.0mM過(guò)氧化物歧化酶Mn-TBAP(mimetic manganese(Ⅲ) tetrakis(4-benzoic acid) porphyrin chloride)干預(yù)2小時(shí)后，七氟烷預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元拮抗OGD誘導(dǎo)損傷作用的保護(hù)率分別下降至5.4±3.7％(p=0.47; n=18)、6.2±4.1％(p=0.28;n

15、=14)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，七氟烷預(yù)處理后與對(duì)照組比較，MTF-1核定位程度增加了53±1.8％(p＜0.001;n=3)。而在氨基胍和Mn-TBAP干預(yù)組，MTF-1核定位增加程度分別為-6.2±3.9％(n=3)和17±4.2％(n=3)。3)七氟烷、SNAP及巴拉刈預(yù)處理對(duì)MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神經(jīng)元拮抗OGD誘導(dǎo)損傷的保護(hù)率分別為(0.75±0.2％;n=22;p=0.80),(-1.43±0.9％; n=24,

16、p=0.66),and(-5.8±3.2％; n=14,p=0.31)。LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)單獨(dú)預(yù)處理對(duì)MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神經(jīng)元毒性作用不明顯，單獨(dú)七氟烷、SNAP及巴拉刈預(yù)處理的神經(jīng)毒性作用分別為:(13±7.9％;n=8; p=0.27)、(-4.0±1.5％;n=8;p=0.57; n=8)及（9±4.0％;n=8; p=0.21），差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western結(jié)果表明，七氟烷、SNAP及巴拉刈預(yù)處理組MT-Ⅰ+Ⅱ基因

17、敲除的神經(jīng)元細(xì)胞核中MTF-1的表達(dá)水平分別高出對(duì)照組3.0±9.7％，18±3.0％，and31±2.7％(n=3)。
　　結(jié)論:1.在麻醉劑延遲預(yù)處理過(guò)程中，阻止NO或者過(guò)氧化物的產(chǎn)生，降低了保護(hù)作用和MTF-1的核定位;2.NO和過(guò)氧化物激動(dòng)劑單獨(dú)作用也產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)物的保護(hù)作用，也相應(yīng)增加了MTF-1的核定位;3.將金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ的基因敲除，不但能夠降低由NO和過(guò)氧化物介導(dǎo)的保護(hù)作用，同時(shí)也能降低七氟烷預(yù)處理介導(dǎo)的核內(nèi)