高糖、高胰島素對樹突狀細胞成熟及清道夫受體表達的影響及其機制.pdf

1、第一部分高糖和高濃度胰島素對樹突狀細胞免疫成熟的影響
　　目的:糖尿病是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的重要危險因素，但其引起AS機制尚不明確。樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職性抗原提呈細胞(APC)，近年來研究發(fā)現(xiàn)DCs參與了AS的免疫炎癥反應(yīng)的過程。本部分探討不同濃度葡萄糖和胰島素對人單核源的樹突狀細胞(monocytederived dendritic cells，MoDCs)分化成熟、

2、免疫功能的影響。
　　方法:采用免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細胞，在含重組人粒-單核細胞集落刺激因子(rhGM-C SF，100ng/ml)和重組人白細胞介素-4(rhIL-4，50ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)五天使其分化為未成熟DCs，在細胞培養(yǎng)的第六天，一組細胞分別加入終濃度為5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖和30mmol/L甘露醇;另一組細胞分別加入終濃度為1nmol/L、10nmol/L、

3、100nmol/L濃度的胰島素，干預(yù)24h后采用流式細胞術(shù)檢測DCs表型(CD83、CD86、HLA-DR); FITC標(biāo)記的Dextran檢測DCs吞噬功能;ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素-12(IL-12)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子的濃度。
　　結(jié)果:與正常濃度葡萄糖(5.5mol/L)組相比，高濃度葡萄糖(15mol/L、30mmon/L)干預(yù)呈濃度依賴

4、性上調(diào)DCs表面共刺激分子CD86和成熟度標(biāo)志HLA-DR、CD83的表達，且分泌細胞因子IL-6、IL-12和TNF-α水平明顯升高，也呈濃度依賴性，IL-10的水平則較正常濃度葡萄糖明顯下降;與正常葡萄糖組相比，高濃度葡萄糖明顯降低了DCs的吞噬功能。與濃度1nmol/L胰島素干預(yù)組相比，10nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素干預(yù)呈濃度依賴性上調(diào)了CD86、CD83、HLA-DR表面分子的表達，細胞因子IL-6、IL-12

5、和TNF-α水平呈濃度依賴性升高，IL-10的水平則明顯下降;與1nmol/L胰島素組相比，100nmol/L胰島素明顯降低了DCs的吞噬功能。
　　結(jié)論:高糖和高濃度胰島素是胰島素抵抗的重要組分，高濃度葡萄糖和高濃度胰島素是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素，這可能是DCs參與糖尿病動脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生的重要機制之一。
　　第二部分高糖和高濃度胰島素對樹突狀細胞清道夫受體表達的影響
　　目的:清道夫受體S

6、R-A、CD36、LOX-1在DCs攝取抗原及免疫功能成熟過程中起了重要作用，本部分探討不同濃度葡萄糖和胰島素對DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1表達及DCs攝取氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的影響，并進一步觀察SR-A、CD36、LOX-1在DCs攝取oxLDL過程中的作用。
　　方法:采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CDi4+單核細胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的

7、RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。一組細胞分別加入終濃度為5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖，另一組細胞分別加入終濃度為1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素，干預(yù)24h后，收集細胞。采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot方法檢測DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達。同時，用不同濃度葡萄糖和胰

8、島素干預(yù)DCs24小時后，加入或不加入SR-A、CD36、LOX-1阻斷抗體，將DCs與Dil標(biāo)記的oxLDL共同孵育3小時，采用激光共聚集方法觀測DCs吞噬oxLDL情況，并用流式細胞術(shù)進行定量分析。
　　結(jié)果:與5.5mol/L葡萄糖組相比，在mRNA和蛋白水平，15mol/L、30mmon/L均可明顯上調(diào)DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達(p＜0.05)，與5.5mmol/L葡萄糖干預(yù)組相比，30mmo

9、l/L葡萄糖明顯促進DCs吞噬oxLDL的能力(p＜0.05），該作用可被SR-A、CD36抗體阻斷，但LOX-1沒有此種作用。另外，與濃度1nmol/L胰島素干預(yù)組相比，10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素顯著上調(diào)了SR-A、CD36、LOX-1的表達(p＜0.05)，并且呈濃度依賴性，100nmol/L胰島素較1nmol/L胰島素明顯促進DCs吞噬oxLDL的能力(p＜0.05），同樣該作用可被SR-A

10、、CD36抗體阻斷，但LOX-1沒有此種作用。
　　結(jié)論:高糖和高濃度胰島素明顯上調(diào)DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達;并且高糖和高濃度胰島素促進DCs攝取oxLDL，這一過程主要通過SR-A和CD36完成的。高糖和高濃度胰島素對DCs清道夫受體表達的影響可能是糖尿病促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個重要機制。
　　第三部分高糖和高濃度胰島素對樹突狀細胞清道夫受體表達影響的機制研究
　　目的:探討高糖

11、和高濃度胰島素對DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1表達影響的作用機制。
　　方法:采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。為研究葡萄糖對DCs清道夫受體表達影響，將細胞分為下列五組①5.5mmol/L葡萄糖、②30mmol/L葡萄糖、③30mmol/L葡萄糖+SB20

12、3580(p38MAPK阻斷劑)、④30mmol/L葡萄糖+NAC(ROS阻斷劑)、⑤30mmol/L葡萄糖+BAY11-7082(NF-κB阻斷劑)，采用Real-time PCR法和Western-blot法分別檢測DCs清道夫受體SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表達;同時在前四組中，采用Western blot法檢測核蛋白中NF-κB p65的表達情況。為研究胰島素對DCs清道夫受體表達的影響，將細胞分為下列四組①

13、1noml/L胰島素、②100nmol/L胰島素、③100mmol/L胰島素+LY294002（PI3K抑制劑）④100mmol/L胰島素+PD98059(MAPK抑制劑)，采用Real-time PCR法和Western-blot法分別檢測DCs清道夫受體SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表達。
　　結(jié)果:與5.5mmol/L葡萄糖組相比，30mmol/L葡萄糖明顯促進DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1

14、mRNA和蛋白的表達，SB203580、NAC、BAY11-7082預(yù)處理可明顯抑制SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表達;同時，30mmol/L葡萄糖干預(yù)較5.5mmol/L葡萄糖明顯促進NF-κB p65的表達，SB203580、NAC可明顯抑制其表達。另外，與1noml/L胰島素組相比，100nmol/L胰島素明顯促進DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表達，PD98059可明顯抑制100nm