黑素瘤三維培養(yǎng)模型的建立及肉桂醛抑制黑素瘤細胞增殖和侵襲的實驗研究.pdf

1、惡性黑素瘤(malignantmelanoma，MM)是一種高度惡性的腫瘤，是皮膚腫瘤中侵襲性和致死性最強的一種，嚴重威脅人類生命健康。惡性黑素瘤無限增殖和侵襲性生長是決定其臨床預后的關鍵因素。因此研究惡性黑素瘤細胞的生物學特點，尋找有效抑制其增殖和侵襲的方法，是惡性黑素瘤防治研究的重要切入點。
　　二維培養(yǎng)是研究黑素瘤細胞生物學特性的主要手段，能直觀和便利地反映黑素瘤細胞的一部分生物學特性，但因缺少細胞-細胞間和細胞-基質間的相

2、互作用和信息交流，黑素瘤細胞的部分特性與在體時比較存在差異，不能全面反映黑素瘤細胞的生物學特性。而三維培養(yǎng)提供的空間結構和生長環(huán)境可模擬體內的情況，能更真實地反映細胞-細胞間和細胞-基質間的相互作用。本實驗室已在體外成功構建了復方殼多糖組織工程皮膚，在此基礎上建立黑素瘤的體外三維培養(yǎng)模型，對于研究惡性黑素瘤的生物學特性以及進行藥物療效評價更具優(yōu)勢。目前多種不同的黑素瘤細胞株已被分離培養(yǎng)，并用于黑素瘤的生物學特性研究，本研究使用的A375

3、細胞具有較強侵襲能力，是皮膚黑素瘤細胞株中具有代表性的一種。
　　肉桂醛是一種醛類有機化合物，除了作為食品添加劑外，也具有抗真菌、抗病毒和抗腫瘤等醫(yī)藥效應。本實驗首先在二維培養(yǎng)條件下觀察了肉桂醛對人皮膚黑素瘤A375細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，然后在實驗室原有組織工程皮膚的基礎上加入A375細胞，建立黑素瘤三維培養(yǎng)模型，進一步檢測了肉桂醛在三維培養(yǎng)條件下對A375細胞增殖和侵襲的影響。本研究方法、結果和結論分述如下:
　　方

4、法:
　　1、A375細胞體外擴增，貼壁生長近融合后，在培養(yǎng)基中分別加入0（對照組）、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，ELISA、westernblot法檢測VEGF表達水平，明膠酶譜法檢測MMP-9分泌水平，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，transwell實驗檢測細胞侵襲情況。
　　2、將A375細胞加至復方殼多糖膠原凝膠的支架內行三維培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中分別加入0（對照組）

5、、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法檢測細胞增殖情況，ELISA、westernblot法檢測VEGF表達水平，明膠酶譜法檢測MMP-9分泌水平。
　　3、分別在組織工程皮膚基質表面和基質中接種A375細胞，進行氣-液面交界培養(yǎng)或浸沒培養(yǎng)，HE染色觀察A375細胞生長情況，選擇最合適的接種方式和培養(yǎng)方法，以便構建符合體內實際情況的黑素瘤三維培養(yǎng)模型。
　　4、采用二步酶分離方法分離培養(yǎng)KC、FB，并連續(xù)傳代。在組織工程

6、皮膚基礎上加入A375細胞，在培養(yǎng)第5、10和15天固定組織工程皮膚標本，HE染色觀察A375細胞生長和侵襲情況，透射電鏡觀察A375細胞生長形態(tài)，免疫組織化學觀察E-Cadherin、PCNA、MMP-9表達情況。
　　5、皮膚惡性黑素瘤三維培養(yǎng)的第5天開始在培養(yǎng)基內分別加入肉桂醛溶液，培養(yǎng)第10、15天固定組織工程皮膚標本，HE染色觀察A375細胞生長和侵襲情況，免疫組織化學觀察PCNA、MMP-9表達情況。
　　6、二

7、維和三維培養(yǎng)的A375細胞經(jīng)肉桂醛處理后，基因芯片檢測氧化應激相關基因表達，ELISA法檢測NF-κB活化情況。
　　結果:
　　1、肉桂醛能促進A375細胞凋亡，降低細胞增殖指數(shù)。10μM肉桂醛作用24小時即能抑制A375細胞增殖，10、20、40μM肉桂醛間的抑制強度具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。40μM的肉桂醛作用72小時后細胞增殖抑制率最高，達88.91±4.5％。與對照組(0μM)相比，40μM肉桂醛作用后A37

8、5細胞增殖指數(shù)最低（53.38±4.25％vs35.13±3.24％），細胞凋亡百分比最高（4.37±0.25％vs10.50±0.37％）。各濃度間作用差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。肉桂醛能抑制三維支架內A375細胞的增殖，促進其凋亡，10、20、40μM肉桂醛間的抑制強度具有統(tǒng)計學意義并呈劑量依賴性(P＜0.01)。
　　2、肉桂醛能抑制A375細胞的遷移，也能抑制A375細胞的侵襲，抑制強度和肉桂醛濃度成正比，各濃度間

9、作用差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、肉桂醛作用后二維和三維支架內A375細胞VEGF的蛋白表達下降(2D:1.193±0.195vs0.204±0.017;3D:1.549±0.214vs0.392±0.019)，各濃度間的抑制作用具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。MMP-9的分泌也減少（2D:24885.83±865.80vs14150.77±555.63;3D:29408.50±817.62vs15121.43±4

10、97.95）。各濃度肉桂醛間的抑制強度差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、在組織工程皮膚表面接種A375細胞行氣-液面交界培養(yǎng)是最合適的黑素瘤三維培養(yǎng)方式和方法。在培養(yǎng)第5天即觀察到A375細胞向真皮侵襲，隨培養(yǎng)時間延長，A375細胞侵襲深度越深，第15天皮膚分化良好，大量A375細胞團塊向真皮深部侵襲。腫瘤細胞生長良好，細胞核異形，細胞器豐富。腫瘤細胞E-Cadherin表達缺失，MMP-9和PCNA表達強度隨侵襲深度

11、增加而增強，在培養(yǎng)第5天、10天和15天間的表達強度均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。PCNA的陽性率在培養(yǎng)第5天、10天和15天間均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　5、肉桂醛能抑制三維培養(yǎng)模型內惡性黑素瘤A375細胞的增生和侵襲。肉桂醛作用后A375細胞數(shù)目減少，侵襲深度變淺，微弱表達PCNA和MMP-9。肉桂醛處理前后PCNA和MMP-9的表達也具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　6、肉桂醛能抑制二維和三維培養(yǎng)的