壬二酸（AZA）的抗菌及對(duì)黑素細(xì)胞與黑素瘤細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、目的：探討壬二酸的抗菌作用及其可能的作用機(jī)制，觀察不同培養(yǎng)條件下環(huán)境因素(營(yíng)養(yǎng)與pH值)對(duì)壬二酸抗菌作用的影響，并比較環(huán)境因素的影響。觀察并檢測(cè)壬二酸對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞與鼠黑素瘤細(xì)胞形態(tài)、黑素合成功能的影響。觀察壬二酸誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡的作用。 方法：(1)以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)壬二酸作用后的細(xì)菌存活率及壬二酸的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)；觀察在不同pH值條件下和含不同的營(yíng)養(yǎng)成

2、份的培養(yǎng)條件下，對(duì)壬二酸抗菌作用的影響；采用3H-TdR、3H-UdR和3H-PRO摻入法，觀察壬二酸對(duì)細(xì)菌DNA、RNA和蛋白質(zhì)生物合成的抑制作用； (2)以惡性黑色素瘤鼠B16細(xì)胞株和人表皮黑素(MC)細(xì)胞作為研究對(duì)象，檢測(cè)壬二酸對(duì)B16細(xì)胞和MC細(xì)胞黑素含量和酪氨酸酶(tyrosinase)的影響；TRP-1染色觀察壬二酸作用后細(xì)胞形態(tài)變化； (3)MTT比色法檢測(cè)壬二酸對(duì)B16細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)(FC

3、M)檢測(cè)壬二酸的促B16細(xì)胞凋亡作用；丫啶橙/溴化乙啶染色后，熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡小體。 結(jié)果：(1)壬二酸對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。2隨看壬二酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)細(xì)菌存活率逐漸下降。壬二酸作用48h之后，對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、金葡菌的最小抑菌濃度分別是0.25mol/L、0.125mol/L、0.063mol/L；對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、金葡菌的最小殺菌濃度分別是0.25mol/L、

4、＞0.125mol/L、0.063mol/L。綠膿桿菌、大腸桿菌、金葡菌在不同培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)條件和不同的pH值下，壬二酸作用后細(xì)菌的生長(zhǎng)率均不同；在相同的營(yíng)養(yǎng)條件下，不同pH值時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)率影響依次為pH7.0＞pH6.0＞pH5.6；在相同pH值的環(huán)境中，L-B培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長(zhǎng)率要大于磷酸鹽緩沖液中的細(xì)菌生長(zhǎng)率；pH值對(duì)壬二酸抑菌作用的影響比營(yíng)養(yǎng)因素更明顯。與空白對(duì)照組比較，5mmol/L的壬二酸可明顯抑制綠膿桿菌的DNA的合成(P＜

5、0.01)、大腸桿菌的蛋白質(zhì)的合成(P＜0.01)；與空白對(duì)照組比較，50mmol/L的壬二酸可明顯抑制大腸桿菌、金葡菌的RNA的合成(P＜0.01)。 (2)壬二酸能顯著抑制鼠黑素瘤B16細(xì)胞和人表皮黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素的合成，而且呈濃度依賴(lài)性；與空白對(duì)照組比較，0.1mmol/L的壬二酸即顯示抑制人表皮黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素的合成(P＜0.01)；相同濃度的壬二酸對(duì)B16細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素合成也有抑制作用

6、(P＜0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照0.5μmol/L氫醌相比，0.5mmol/L壬二酸的作用顯著高于氫醌(P＜0.05)。壬二酸作用人表皮黑素細(xì)胞72h后，可見(jiàn)細(xì)胞樹(shù)突減少，正常表皮黑素細(xì)胞樹(shù)突多為3～5極，多的可達(dá)10極，而藥物作用后，可見(jiàn)細(xì)胞樹(shù)突減少至1～3極；而壬二酸作用于鼠黑色素瘤B16細(xì)胞72h后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。 (3)壬二酸對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。與空白對(duì)照組比較，0.1mmol/L的壬二酸作用

7、于B16細(xì)胞24h后，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，而1.0mmol/L的壬二酸對(duì)B16細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用較明顯，差異有顯著性(P＜0.05)，同一濃度的壬二酸作用于B16細(xì)胞不同時(shí)間，差異也具有顯著性(P＜0.05)，高濃度(10mmol/L)時(shí)，B16細(xì)胞出現(xiàn)壞死；壬二酸濃度在5mmol/L時(shí)，熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)顯示細(xì)胞周期G1前出現(xiàn)凋亡峰，且隨著藥物濃度的增加，其平均凋亡指數(shù)逐漸增加。

8、 結(jié)論：(1)壬二酸可以抑制綠膿桿菌、大腸桿菌、金葡菌的生長(zhǎng)，較高濃度時(shí)具有殺菌作用。其抑菌作用與營(yíng)養(yǎng)和pH值有關(guān)，營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，壬二酸的抑菌率下降，pH值改變對(duì)壬二酸的抑菌作用的影響更為顯著； (2)壬二酸作用于人表皮黑素細(xì)胞后，細(xì)胞樹(shù)突由原來(lái)的3～5個(gè)變?yōu)?～2個(gè)。但對(duì)于惡性黑素瘤細(xì)胞形態(tài)改變影響較小。壬二酸可以降低表皮黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素合成，且具有濃度依賴(lài)性； (3)壬二酸抑制黑素瘤細(xì)胞的