空泡型質(zhì)子泵V-ATPases在胃癌增殖侵襲中的作用及山荷葉素干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 胃癌是常見(jiàn)消化道惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌患者死亡率較高。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是治療失敗及復(fù)發(fā)的重要原因，臨床尚缺乏有效的干預(yù)措施。
　　 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與空泡型質(zhì)子泵(thevacuolarH+-adenosinetriphosphatase，V-ATPases)密切相關(guān)。在腫瘤組織中V-ATPases高表達(dá)，并能夠感知細(xì)胞內(nèi)pH，以ATP為能量，將癌細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)多的H+泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致胞外的酸性

2、微環(huán)境。國(guó)內(nèi)上海交通大學(xué)腫瘤研究所通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制V-ATPases的基因表達(dá)，有效抑制了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但V-ATPases在利用質(zhì)子泵功能維持細(xì)胞內(nèi)外特定的pH值同時(shí)，又作用于哪些信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，尚未明確。本研究擬通過(guò)沉默胃癌細(xì)胞SGC7901中V-ATPases表達(dá)，研究V-ATPases與Wnt/B-catenin信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　 近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些藥物及分子能抑制V-ATPases

3、，如巴弗洛霉素、NIK12192及FR202126等，但尚無(wú)相關(guān)藥物進(jìn)入臨床。山荷葉素是傳統(tǒng)中藥山荷葉提取物的主要成分，屬于木脂素類(lèi)化合物，具有較好的抗腫瘤活性，而對(duì)正常細(xì)胞毒性很小。但山荷葉素抗腫瘤的確切機(jī)制尚未完全清楚。近來(lái)有研究表明，山荷葉素能抑制破骨細(xì)胞的V-ATPases的活性，且抑制活性與山荷葉素有劑量依賴(lài)關(guān)系。那么山荷葉素對(duì)胃癌細(xì)胞V-ATPases是否同樣具有抑制作用，且效應(yīng)如何？國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道?；谏鲜鲅芯壳疤幔?/p>

4、項(xiàng)目選擇了山荷葉素作為胃癌細(xì)胞V-ATPases抑制劑，研究其阻斷Wnt/B-catenin信號(hào)通路的作用及與胃癌細(xì)胞增殖侵襲的關(guān)系。
　　 本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:第一部分研究V-ATPases蛋白表達(dá)和胃癌臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性;第二部分研究沉默V-ATPases基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC7901增殖和侵襲能力的影響及機(jī)制;第三部分為山荷葉素調(diào)控V-ATPases對(duì)胃癌細(xì)胞增殖侵襲影響的體內(nèi)外研究。
　　 第一部分、V-A

5、TPases蛋白表達(dá)和胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性研究
　　 目的:研究V-ATPases蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。
　　 方法:運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)50例胃癌組織、正常組織的V-ATPases蛋白表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析V-ATPases表達(dá)與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果:胃癌組織中V-ATPases蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76％，高于正常組織(30%)。胃癌組織中V-ATPases

6、表達(dá)與腫瘤大小(P=0.017)、病理分級(jí)(P=0.038)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)有相關(guān)性，與其它臨床病理特征性別、年齡、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)及TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性；在運(yùn)用Cox回歸單因素模型進(jìn)行單變量分析中，腫瘤大小、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM分期和V-ATPases是重要的預(yù)后影響因素，p值分別為0.000、0.009、0.003、0.000、0.000、0.000。采用Cox比例多因素模型進(jìn)行多變量分析結(jié)果顯示

7、，V-ATPases表達(dá)和TNM分期可能是預(yù)后的獨(dú)立影響因素，p值分別為0.010和0.001。
　　 結(jié)論:V-ATPases在胃癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組織，V-ATPases可能與胃癌發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)。V-ATPases蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是影響胃癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　 第二部分、沉默V-ATPases基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC7901增殖和侵襲能力的影響及機(jī)制
　　

8、目的:利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默人胃癌細(xì)胞株SGC7901的V-ATPases，分析V-ATPases在對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。
　　 方法:對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染siRNA-GAPDH、轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPases的SGC7901細(xì)胞株，采用MTT試劑盒測(cè)定其細(xì)胞的生存率，以及克隆形成試驗(yàn)計(jì)算增殖率;運(yùn)用AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;采用Transwell進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，以確定V-ATPases在

9、胃癌細(xì)胞侵襲中的作用；并測(cè)定干擾前后SGC7901細(xì)胞株中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中LRP磷酸化及對(duì)其下游基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果:SGC7901細(xì)胞株經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPases后，細(xì)胞的增殖、克隆形成能力顯著降低，凋亡率顯著上升，并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染siRNA-V-ATPase后SGC7901細(xì)胞遷移能力下降。以上結(jié)果提示，V-ATPases在胃癌的增殖、侵襲中具有一定

10、作用。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，干擾SGC7901細(xì)胞株V-ATPases表達(dá)后，LRP磷酸化受到抑制，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中下游基因β-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:V-ATPases在胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖、侵襲中具有一定作用，靶向抑制V-ATPases后，胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖、侵襲能力下降，同時(shí)能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中LRP

11、磷酸化。V-ATPases有望成為治療胃癌新的靶點(diǎn)。
　　 第三部分、山荷葉素調(diào)控V-ATPases對(duì)胃癌細(xì)胞增殖侵襲影響的體內(nèi)外研究
　　 目的:研究山荷葉素(diphyllin)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和侵襲的影響，并探討與V-ATPases表達(dá)、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 方法:將不同濃度的diphyllin作用于SGC7901細(xì)胞株不同時(shí)間，采用MTT試劑盒測(cè)定其細(xì)胞的生存率，以

12、及克隆形成試驗(yàn)計(jì)算增殖率。采用Transwell進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，以確定山荷葉素在胃癌細(xì)胞侵襲中的作用;并測(cè)定山荷葉素作用前后SGC7901細(xì)胞株中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中LRP磷酸化及其下游基因表達(dá)的差異。建立裸鼠皮下荷瘤模型，分析diphyllin在裸鼠體內(nèi)對(duì)胃癌生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果:不同濃度的diphyllin作用于SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、克隆形成能力顯著降低，凋亡率顯著上升，并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系

13、,48小時(shí)IC50為7.8μM。5μM、10μM濃度山荷葉素作用后SGC7901細(xì)胞遷移能力下降。同時(shí)，diphyllin能抑制胃癌細(xì)胞中V-APTase基因及蛋白表達(dá)，并降低細(xì)胞內(nèi)pH，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)外pH梯度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，山荷葉素能抑制磷酸化LRP表達(dá)，并下調(diào)其下游基因B-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表達(dá)（P＜0.05）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，裸鼠在給予diphyllin后，移植瘤體積顯著減小，凈體重較對(duì)照組升高，瘤體