大黃素調(diào)節(jié)p38MAPK信號轉導通路抗糖尿病大鼠腎損傷的研究.pdf

1、糖尿病腎損傷(DiabeticNephropathy)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎衰竭的主要原因。P38MAPK是MAPK家族的一員，同JNK一起屬于應激活化蛋白。P38MAPK可以被多種應激因素所激活，如高血糖、高滲透壓、氧化應激、以及一些炎癥因子等。激活后的P38MAPK可以誘導細胞增殖、分化和凋亡。糖尿病狀態(tài)下蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路激活、二?；视蚉KC通路激活及氧化應激等因素都可激活P38MAPK，進而磷酸化轉

2、錄因子，調(diào)節(jié)基因表達，參與DN的發(fā)生與發(fā)展。體外研究表明：高血糖可以激活腎細胞的P38MAPK信號通路，誘導腎小球系膜細胞P38MAPK的磷酸化，使腎臟細胞外基質(zhì)如纖維連接蛋白FN等表達增多。因此，有學者認為：P38MAPK是高糖引起糖尿病腎損傷的信號傳遞子，抑制P38MAPK通路的激活，可以減少腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的形成，減輕腎纖維化，阻止或減緩糖尿病腎損傷的發(fā)生與發(fā)展。大黃素(1、3、8-三羥基-6甲基蒽醌)是中藥大黃抗糖尿病腎病

3、、保護腎功能的主要活性成分。大黃素能以劑量依賴方式抑制成纖維細胞和腎小球系膜細胞的增殖，其機制是抑制細胞從G1期進入S期。大黃素可以通過調(diào)節(jié)c-myc基因的表達促進細胞的凋亡、抑制間質(zhì)纖維化。大黃素產(chǎn)生這些作用的機理不明，目前還未見有相關的報道。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，大黃素無明顯的降血糖作用，表明它抗糖尿病腎損傷的作用與血糖水平無關。有研究表明，部分糖尿病病人的血糖即使控制在正常范圍，糖尿病腎損傷仍持續(xù)發(fā)生、發(fā)展，可見高血糖并

4、不是引起糖尿病腎損傷的唯一因素。通過計算機藥物分子設計分析，我們發(fā)現(xiàn)大黃素分子能夠與P38MAPK空間三維結構的疏水基團結合，提示大黃素可能直接作用于P38MAPK。因此，我們推測大黃素抗糖尿病腎損傷、保護腎功能的作用可能與其抑制P38MAPK信號通路的激活有關。本實驗在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎損傷大鼠模型上，觀察大黃素對糖尿病腎損傷大鼠腎功能的保護作用；并通過測定大黃素對腎組織磷酸化P38MAPK、核轉錄因子—磷酸化應答元件

5、結合蛋白(CREB)及腎小球系膜外基質(zhì)(ECM)的主要成分--纖維連接蛋白(FN)的影響，探討大黃素對P38MAPK信號轉導通路的影響及其抗糖尿病大鼠腎損傷的作用機制。 材料和方法 30只wistar大鼠，體重250±20g,隨機分為3組：正常組、模型組、大黃素組，每組10只，大鼠禁食6小時后，模型組和大黃素組按60mg/Kg.BW的劑量單次腹腔注射STZ，正常對照組注射等體積枸櫞酸緩沖液，72h后大鼠禁食6小時，尾靜脈

6、取血，測定血糖，血糖≥16.7mmol/L為造模成功。模型成功次日，大黃素組按40mg/kg的劑量灌胃給藥，模型對照組及正常對照組均灌胃給予等體積的0.5％醋酸纖維鈉溶液。實驗第12周時，收集標本進行檢測，血糖用葡萄糖氧化酶法檢測，BUN、Scr分別用酶法、速率法由BeckmanCX-5全自動生化分析儀進行檢測,UPE測定用磺基水楊酸—硫酸鈉比濁法。常規(guī)方法制備石臘切片，作HE染色，應用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)6

7、.0測定腎小球平均面積(HCPA)、平均體積(MCV)。免疫組化檢測磷酸化P38，磷酸化CREB在腎臟的定位表達，western-blot檢測腎臟總P38，磷酸化P38，磷酸化CREB，及纖維連接蛋白的半定量表達。 結果 一：大黃素對STZ糖尿病腎損傷大鼠腎功能相關指標的變化影響：與正常對照組相比，實驗第12周時模型對照組體質(zhì)量明顯下降，腎質(zhì)量明顯增加，肥大指數(shù)(腎重/體重)增加，腎小球面積、腎小球體積明顯增加，血糖、2

8、4小時尿蛋白、血肌酐、尿素氮等也明顯升高(P均＜0.05)，提示糖尿病腎損傷大鼠模型成功；大黃素組的腎重、肥大指數(shù)、腎小球面積、腎小球體積、24小時尿蛋白、血肌酐、尿素氮等與糖尿病模型組相比明顯降低(P均＜0.05)，而血糖與模型組相比，雖有降低的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。 二：大黃素對P38MAPK蛋白的影響免疫組化顯示：P-P38MAPK主要表達在腎小球系膜細胞及腎小管細胞胞漿內(nèi)，偶有胞核表達，模型組磷酸化P38

9、MAPK陽性表達相對百分含量明顯高于正常組、大黃素組(P均＜0.05)。 westernblot檢測表明，模型組磷酸化P38MAPK蛋白表達為正常對照組的1.98倍(P＜0.05)，為大黃素組的1.82倍(P＜0.05)；正常組和大黃素組表達無顯著性差異(p＞0.05)；模型組T-P38MAPK表達高于正常組和大黃素組，但三組之間無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；P-P38MAPK與T-P38MAPK的比值，正常組、模型組和大黃素組

10、分別為：0.937、1.393、0.947。 三：大黃素對磷酸化CREB的影響免疫組化顯示：磷酸化CREB主要表達在腎小球系膜細胞，臟層上皮細胞、內(nèi)皮細胞胞核內(nèi)，小管也有部分表達；模型組磷酸化CREB陽性表達相對百分含量明顯高于正常組、大黃素組(P＜0.05)。westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，實驗第12周時，模型組P-CREB灰度均值為正常組的1.94倍(P＜0.05)，大黃素的1.63倍(P＜0.05)，正常組和大黃素組灰度值

11、無顯著性差異(p＞0.05)，三組P-CREB的變化趨勢與P-P38MAPK變化趨勢相同。 四：大黃素對FN的影響westernblot結果表明，實驗第12周時，模型組FN的表達明顯增多，分別為正常對照組的1.96倍(P＜0.05)、大黃素組的1.60倍(P＜0.05)；正常組和大黃素組灰度值無顯著性差異(p＞0.05)。 結論 鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎損傷大鼠模型腎功能明顯受損，腎組織P-P38MAPK，P-C