Sorafenib聯(lián)合肝動脈栓塞治療大鼠種植性肝癌的實驗研究.pdf

1、肝癌是全球最常見的惡性腫瘤，我國更是肝癌高發(fā)地區(qū)。大多數(shù)肝癌患者就診時已是中晚期，失去了手術(shù)治療的機會。對于這類患者，肝動脈化療栓塞(TACE)是非手術(shù)治療肝癌的主要方法之一，已被證明能有效延長患者生存期。然而，TACE造成栓塞部位局部缺氧，刺激血管生成，可能是其術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并影響治療效果及預(yù)后的主要因素。索拉非尼(Sorafenib)是一種新型多靶點分子靶向藥物，一方面通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長；另一

2、方面通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。雖然sorafenib己被證實可延長無法切除晚期肝癌患者生存期，但其僅能延長3個月左右時間。因此，將TACE與soafenib這兩種有效的治療方法聯(lián)合應(yīng)用，有可能克服單獨治療的缺點，進(jìn)一步提高對肝癌的治療效果。
　　本課題旨在研究索拉非尼(sorafenib)聯(lián)合肝動脈栓塞(TAE)對肝癌的治療作用。采用大

3、鼠Walker256腫瘤細(xì)胞、離體主動脈環(huán)模型，通過對細(xì)胞凋亡、增殖及血管生成等相關(guān)分子的檢測，從分子、細(xì)胞、組織水平研究sorafenib在體外對腫瘤細(xì)胞及血管生成的抑制作用及其可能的作用機制。采用經(jīng)頸動脈途徑肝動脈栓塞聯(lián)合sorafenib灌胃，治療大鼠原位種植性肝癌模型，研究兩者在體內(nèi)的協(xié)同作用及其可能的治療機制。
　　第一部分、Sorafenib抑制大鼠Walker256腫瘤細(xì)胞及微血管形成的體外實驗研究
　　目的：

4、探討sorafenib對體外培養(yǎng)的大鼠Walker256腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的抑制作用以及對大鼠主動脈環(huán)微血管形成的影響。
　　方法：應(yīng)用CCK-8法檢測sorafenib在不同藥物濃度(0-10μmol/l)和不同作用時間(24-72h)對大鼠Walker256腫瘤細(xì)胞株生長增殖的抑制作用；AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞法檢測其對細(xì)胞凋亡的作用；觀察Millicell細(xì)胞遷移小室中腫瘤細(xì)胞遷移能力的變化。采

5、用體外基質(zhì)膠大鼠主動脈環(huán)血管新生模型，在含不同濃度sorafenib(0-10μmol/l)及VEGF(10ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，以圖像分析軟件(IPP)定量并分析sorafenib對體外基質(zhì)膠中培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)出芽性血管新生的影響。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度sorafenib(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用Walker25

6、6細(xì)胞不同時間后(24h、48h、72h)，對體外培養(yǎng)的大鼠Walker256腫瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，抑制增殖作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著藥物濃度及作用時間的增加，Sorafenib對Walker256細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用增強，誘導(dǎo)凋亡作用呈現(xiàn)劑量與時間依賴關(guān)系。遷移實驗結(jié)果顯示，以溶劑對照組作為參照，VEGF能明顯增加細(xì)胞的遷移量，而sorafenib能明顯抑制VEGF所誘導(dǎo)的Walker256腫瘤細(xì)胞遷移

7、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。同時，Sorafenib呈濃度依賴性抑制基質(zhì)膠中培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)出芽性血管生成數(shù)，并可顯著減少VEGF誘導(dǎo)的血管新生。
　　結(jié)論：Sorafenib對體外培養(yǎng)的Walker256腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、減少遷移及促進(jìn)凋亡的作用，并能明顯抑制大鼠主動脈環(huán)血管新生。
　　第二部分、大鼠種植性肝癌模型的建立及肝動脈栓塞方法的改進(jìn)
　　目的：采用不同方法建立大鼠原位種植性肝癌模型，探討經(jīng)頸動

8、脈途徑大鼠肝動脈栓塞技術(shù)的可行性，為該模型及栓塞技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：分別采用開腹細(xì)胞懸液注射法或腫瘤組織塊包埋法建立大鼠原位種植性肝癌模型。腫瘤種植7天后，按預(yù)定時間點對荷瘤鼠行肝臟平掃及增強MRI檢查。肝臟腫瘤種植14天后，將其中10只大鼠隨機分為2組(5只/組)，分別經(jīng)左頸總動脈(LCCA)途徑肝動脈造影及栓塞或開腹直視下經(jīng)胃十二指腸動脈(GDA)逆向插管肝動脈栓塞。肝動脈栓塞后分別于第0、3、7、14、

9、21天行MR掃描后，每組隨機處死1只荷瘤鼠行病理學(xué)檢查，并與磁共振結(jié)果進(jìn)行對照。
　　結(jié)果：腫瘤組織塊包埋法大鼠肝癌種植成功率100％，細(xì)胞懸液注射法種植成功率58.33％，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。兩種途徑栓塞方法技術(shù)成功率均為100％。經(jīng)頸動脈途徑肝動脈造影顯示大鼠Walker256肝臟原位種植腫瘤血管染色豐富。MRI檢查示腫瘤實質(zhì)部分T1WI呈等低信號，T2WI呈稍高信號，增強掃描病灶邊緣環(huán)狀強化。大體病理顯

10、示腫瘤為白色，剖面呈魚肉狀。低倍鏡下可見肝內(nèi)浸潤性癌巢，與肝實質(zhì)無明顯邊界。高倍鏡下腫瘤細(xì)胞體積大，胞漿豐富，淡紅染色，核肥大，核分裂像多見。栓塞后MRI掃描腫瘤壞死部分呈長T1、長T2信號。大體病理示腫瘤為灰白色，腫瘤中心可見豆腐渣樣壞死組織，光鏡下出現(xiàn)大片壞死區(qū)及多個片狀或灶性壞死，大部分腫瘤細(xì)胞核碎裂、核溶解。
　　結(jié)論：采用瘤塊包埋法制備大鼠肝癌模型成功率高，腫瘤模型性質(zhì)穩(wěn)定且多為孤立性病灶，轉(zhuǎn)移少見。MRI可很好地監(jiān)測腫

11、瘤生長及病理學(xué)變化。經(jīng)頸動脈途徑行大鼠肝動脈栓塞方法可行，尤其適用于肝癌動脈栓塞治療的基礎(chǔ)研究。
　　第三部分、Sorafenib聯(lián)合肝動脈栓塞(TAE)治療大鼠種植性肝癌的實驗研究
　　目的：探討口服sorafenib聯(lián)合肝動脈栓塞(TAE)治療大鼠原位種植性肝癌的可行性及治療效果。
　　方法：56只Walker256原位肝癌荷瘤大鼠被隨機分成四組(14只/組)。原位肝癌大鼠模型種植14天后，第一組以Embosphe

12、re微球(直徑40μm-110μm)行肝動脈栓塞(TAE)聯(lián)合sorafenib(80mg/kg/天)灌胃治療；第二組給予sorafenib(80mg/kg/天)灌胃治療；第三組以同樣Embosphere微球行肝動脈栓塞治療；第四組以肝動脈灌注生理鹽水(NS)作為對照。采用對比劑增強磁共振成像(CE-MR)分別以實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)及歐洲肝病協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)(EASL)評估治療效果。生化檢查測量肝腎毒性反應(yīng)。HE染色法評價腫瘤壞死

13、率及轉(zhuǎn)移率。免疫組化法檢測細(xì)胞增殖(PCNA)、細(xì)胞凋亡(TUNEL)、微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平。免疫印跡法(WesternBlot)測量腫瘤血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的表達(dá)情況。Kaplan-Meier法計算大鼠生存率。
　　結(jié)果：所有大鼠均出現(xiàn)一過性肝臟毒性。肝動脈栓塞聯(lián)合sorafenib治療2周可有效抑制腫瘤生長并延長荷瘤鼠生存時間。與各對照組