氧化性低密度脂蛋白和膽固醇對HepG2細胞脂肪積累及SIRT1-LXR信號通路的影響.pdf

1、目的：
　　探討氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)和膽固醇(Cholesterol,CH)對肝細胞內脂肪積累以及對SIRT1-LXR和NF-κB-TNFα信號通路的影響,深入探討脂肪肝等代謝綜合癥形成的分子機制。
　　研究表明,脂肪肝發(fā)病過程中不僅涉及脂代謝紊亂、脂肪積累、同時還伴隨著炎癥反應,多種因素參與了該病的發(fā)病過程,它是一種復雜的代謝性疾病。SIRT1參

2、與多種信號通路調控,具有預防高脂飲食所造成的脂肪肝等代謝性疾病、延長壽命的作用,該信號路的調控過程涉及細胞程序性死亡,細胞分化以及能量代謝等;肝細胞X受體(liver X-activated receptors,LXR)是核受體超家族成員,主要調控膽固醇吸收、轉運、代謝等過程,維持體內甾醇和脂代謝和糖代謝平衡,同時參與炎癥反應的調節(jié)。ATP結合盒轉運蛋G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG

3、1)是LXRα的靶分子,參與膽固醇轉運、調節(jié)脂代謝,參與凋亡細胞清除和有毒物質去除等。另外有報道,在脂肪肝等代謝綜合癥發(fā)生過程中,炎癥反應誘導的轉錄因子(如NF-κB)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)等多種炎癥因子明顯增高;而SIRT1過表達或被激活,NF-κB的乙?；潭缺銜艿揭种?從而會抑制炎癥反應信號通路、減輕細胞損傷、改善糖代謝。
　　基于以上背景,我們推測:在高脂或/和高ox

4、LDL、CH環(huán)境,肝細胞中正常脂代謝受到影響,SIRT1-LXR信號通路可能受到抑制而NF-κB-TNFα炎癥信號通路被激活,從而造成脂肪肝的形成。
　　方法：
　　實驗細胞分為7組:高糖對照組、氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)組、高脂(high-fat,HF)組、HF+oxLDL組、高膽固醇組(CH)、能量限制(calorie restriction,CR)+CH組、CR組。其中除CR+CH和CR組細胞培養(yǎng)于低糖DMEM培

5、養(yǎng)基中,其他各組細胞均培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中。另外,HF組培養(yǎng)基中加入0.1mmol/l的軟脂酸鈉;oxLDL組培養(yǎng)基中加入80μg/ml的oxLDL;HF+oxLDL組培養(yǎng)基中加入80μg/ml的oxLDL和0.1mM的軟脂酸鈉;CH組培養(yǎng)基中添加0.75g/L膽固醇;CR+CH組培養(yǎng)基加入0.75g/L膽固醇。細胞培養(yǎng)24h后用四氮唑藍比色分析法(MTT)檢測細胞活力,確定CH有效作用濃度;培養(yǎng)48h后用油紅O染色法定性拍照觀察

6、和通過測定OD值定量檢測細胞內脂肪積累,并采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測SIRT1、LXRα及其靶基因ABCG1和NF-κB,TNFαmRNA相對表達水平。
　　定量油紅O染色法檢測細胞內脂肪積累用spss15.0進行協(xié)方差分析(analysis of covariance);繪圖和mRNA定量分析用Graph Pad Prism 5,組間比較用one-way ANOVA(and nonparametric)方法

7、(Test name為Newman-Keuls,即SNK法)。P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　MTT檢測結果顯示,CH濃度從0g/L上升到0.125g/L,細胞活力顯著下降,CH濃度在0.125-1.0g/L時,細胞活力基本保持穩(wěn)定,濃度高于1.0g/L細胞活力進一步迅速下降。與對照組比,oxLDL組、CH組、HF組、HF+oxLDL組和HF+CH組細胞內脂肪含量均增加(P<0.05),CR組細胞中脂肪含量

8、降低(P<0.05),HF+CH組要比HF組高(P<0.05);而oxLDL組和HF+oxLDL組脂肪含量比較接近,差異也不具有統(tǒng)計學意義,并且它們分別低于HF組(均P<0.05);CH組和HF+CH組脂肪含量較接近,差異不具有統(tǒng)計學意義。RT-PCR結果顯示,與對照組比,CH組和CH+CR組SIRT1、LXRα和ABCG1mRNA表達均增加(均P<0.05);oxLDL組SIRT1、LXRα和ABCG1三種分子mRNA表達均增加,其中

9、SIRT1和LXRα差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);HF+CH組三種分子mRNA表達均降低,其中SIRT1和LXRα差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);HF組SIRT1和LXRα與對照比差異無統(tǒng)計學意義,而ABCG1顯著低于對照(P<0.05);HF+oxLDL組LXRα和ABCG1表達均顯著降低(均P<0.05),而SIRT1與對照組比差異無統(tǒng)計學意義。NF-κB,TNFα分子mRNA表達結果前后差異較大,結果不具有統(tǒng)計學意義。<

10、br>　　結論：
　　oxLDL、CH和HF均可使脂肪在肝細胞中堆積,其中CH使細胞中脂肪積累較多。在HF中加入oxLDL或CH,肝細胞中脂肪可能會進一步增加。oxLDL、CH對三種mRNA影響具有相似性,它們都能夠使SIRT1、LXRα和ABCG1三種分子表達增加,而oxLDL+HF、CH+HF可以抑制這三種分子mRNA的表達,并且oxLDL+HF、CH+HF對三種分子mRNA的抑制作用可能要大于單獨HF。因此,oxLDL或CH