MMP-2基因沉默對卵巢癌細胞轉移能力和血管形成的影響.pdf

1、研究背景：
　　由于缺少明顯的臨床癥狀、發(fā)病隱匿，多數(shù)卵巢癌病人就診時已屬晚期。盡管給予減瘤術及基于鉑類的術后化療，患者的5年生存率仍然僅30％左右。因此，迫切需要尋找提高卵巢癌治療效果的新治療方法。侵襲轉移是導致卵巢癌患者死亡的主要原因。研究顯示基質金屬蛋白酶2(MMP-2)在卵巢癌的侵襲和轉移過程中起著重要作用，它降解基底膜，導致腫瘤細胞轉移，并且釋放包括血管內皮生長因子(VEGF)在內的多種促腫瘤血管形成因子。MMP-2和V

2、EGF與卵巢癌的轉移和不良預后有關。近些年來，研究顯示MMP-2的沉默可抑制多種腫瘤的轉移和血管形成，VEGF抑制劑貝伐單抗也被批準用于晚期卵巢癌的治療，但是利用功能強大的RNA干擾技術抑制MMP-2基因在卵巢癌轉移和血管形成中的作用還缺少研究，本課題將對此進行相關的研究。
　　研究目的：
　　利用RNA干擾技術沉默人卵巢癌細胞株OVCAR-3中MMP-2基因，觀察其生長、粘附、侵襲及遷移能力的變化，并檢測卵巢癌細胞誘導的體

3、外血管形成能力變化，以探討MMP-2基因對卵巢癌細胞轉移和血管形成的影響。
　　研究方法：
　　1.人卵巢癌細胞株OVCAR-3和人臍靜脈內皮細胞HUVECs的培養(yǎng)：含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2. siRNA的設計、合成：設計、合成3對靶向MMP-2基因的小分子干擾RNA(siRNA)和1對陰性對照siRNA(s

4、iRNA-NC)，以與siRNA等體積的DMEM轉染作為空白對照組，利用Real-Time quantitative PCR技術檢測轉染后MMP-2 mRNA的表達，獲得MMP-2基因沉默效果最佳的siRNA，并用于用于后續(xù)試驗；
　　3.用沉默效率最佳siRNA轉染OVCAR-3細胞，通過Real-Time quantitative PCR、Western Blot技術檢測細胞中不同時間MMP-2和VEGF的mRNA及蛋白表達。

5、
　　4.利用MTT實驗繪制細胞生長曲線，檢測MMP-2基因沉默后OVCAR-3細胞生長情況。
　　5.利用體外粘附實驗檢測MMP-2基因沉默后OVCAR-3細胞60 min時及90 min時的粘附能力，并計算黏附抑制率。
　　6.利用Transwell小室細胞侵襲實驗檢測MMP-2基因沉默后OVCAR-3細胞侵襲能力的變化。
　　7.利用劃痕實驗檢測MMP-2基因沉默后OVCAR-3細胞遷移能力。
　　8

6、.利用體外血管形成實驗檢測OVCAR-3細胞誘導的體外血管形成能力，觀察所形成的管狀結構，計算每視野管型分支數(shù)量及其長度。
　　9.統(tǒng)計分析：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料的結果以?±s表示，組間比較采用one way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.轉染后MMP-2基因表達受到抑制，并且不同序列抑制作用不同，沉默效率最高者達77.8%，并用此序列進行后續(xù)試驗。<

7、br>　　2.與陰性對照組相比，轉染后24h、48h和72h實驗組的MMP-2 mRNA水平分別下降73.8%、78.8%和78.4%，各實驗組與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，實驗組之間比較僅48h和72h組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.654)。與陰性對照組比較，轉染后48h實驗組VEGF mRNA水平下降75.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3.與陰性對照組比較，轉染后24h、48h和72h各實驗

8、組MMP-2蛋白表達水平分別下降72.6%、81.2%和76.4%，各實驗組與陰性對照組比較以及實驗組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與陰性對照組比較，轉染后48h實驗組VEGF蛋白水平下降78.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　4. MTT試驗結果提示RNA干擾MMP-2基因對OVCAR-3細胞生長無明顯影響。
　　5.細胞體外黏附試驗結果顯示，與陰性對照組比較，培養(yǎng)60min時和90min時試驗組

9、OVCAR-3細胞的粘附能力均明顯下降，粘附抑制率分別為42.1%和50.4%。各自與其陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　6.細胞體外侵襲試驗結果顯示，與陰性對照組(141.2±22.7)和空白對照組(140.1±24.1)相比，實驗組(99.2±8.3)平均穿過濾膜細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。
　　7.體外劃痕實驗結果提示RNAi干擾MMP-2基因后OVCAR-3細胞遷移能力明顯降低。劃痕后12小

10、時，實驗組遷移距離為120±14μm,明顯低于陰性對照組(187±23μm)和空白對照組(186±17μm)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　8.體外血管形成實驗結果顯示，RNAi干擾OVCAR-3細胞MMP-2基因后，所獲得條件培養(yǎng)基誘導的血管形成能力明顯下降。與陰性對照組比較，實驗組管狀結構的總長度和分支數(shù)分別減少52.9%和47.5%。各自與其陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結論：