日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結合肽的親和篩選與功能鑒定.pdf

1、血吸蟲病是一種重要危害人類身體健康和經濟發(fā)展的寄生蟲病，是世界主要公共衛(wèi)生問題之一。當前，用于血吸蟲病防治的方法，盡管有抗病原藥物-吡喹酮用于人、畜化療以控制病情和減少傳染源，有殺中間宿主的氯硝柳胺等遙藥用于人畜活動頻繁的易感地帶滅螺滅蚴，有豐富的家畜管理和人群健教的經驗，但很難控制其流行傳播，這說明現行防治技術尚存在不足。例如，在防治中起關鍵作用的吡喹酮，不僅只能在一個用藥時點發(fā)揮作用，而且有研究發(fā)現其抗蟲效果在降低。對此，本研究認為

2、在抗感染疫苗和抗蟲新藥尚未問世之前，深入探索提高吡喹酮生物利用度和增強抗蟲效果的方法是解決現場防治技術問題的重要課題之一。眾所周知，殺成蟲的吡喹酮和抗童蟲的青篙素類藥物用于人和家畜體內后表現代謝快和分布面大的特點，從而使藥物的生物利用度低。如何來解決這一問題，本研究依據血吸蟲生物學特性（需通過表膜吸收和結合宿主有關分子作為生長繁殖的因子）提出了蟲體表膜有可能存在與外源分子發(fā)生特異性結合的分子，如能通過篩選獲得，就有可能用其作靶向藥物殺蟲

3、（提高藥物利用度，減少藥物所致毒副反應）。在本文中開展研究解決的關鍵問題是從血吸蟲活蟲體表膜中能篩選和鑒定出具有特異結合能力的多肽分子，并闡明其性質和功能，以期為進一步的靶向藥物制劑等方面研究奠定工作基礎。
　　 第一章日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結合噬菌體短肽的篩選與鑒定
　　 目的:利用噬菌體展示肽對日本血吸蟲尾蚴脫尾活童蟲作體外差異親和淘選，以期獲得對蟲體具有拮抗或/和靶向作用的特異性短肽。
　　 方法:體外差

4、異淘選與S.j脫尾活童蟲結合、與尾蚴不結合的特異性短肽:將噬菌體12肽庫用尾蚴預吸附后，取未與尾蚴結合的噬菌體肽庫擴增后與脫尾童蟲孵育，經洗脫、再擴增后，獲取的目標肽庫再次逆向吸附——擴增——淘選——擴增:經過3輪差異淘選，隨機挑取15個克隆抽提DNA測序;通過氨基酸翻譯和生物信息學分析測序結果;利用噬菌體回收實驗、Western-blot及免疫組織化學檢測分析所得噬菌體克隆與S.j童蟲及成蟲體被結合狀態(tài)。
　　 結果:經3輪體

5、外差異淘選獲得4種不同序列的特異性M13噬菌體短肽MppZL6、MppZL4、MppZL1和MppZL0，其中MppZL0無插入片段;經生物信息學分析，MppZL6、MppZL4及MppZL1短肽均由8～9個親水的極性氨基酸殘基及疏水的非極性氨基酸殘基交錯構成，含精氨酸殘基，等電點分別為6.07，8.75，8.50:BLAST分析表明，MppZL1與家鼠載脂蛋白B有53％(7/13)的同一性，MppZL6與SjCHGC07116蛋白有6

6、9％(9/13)同一性，MppZL4與陰道毛滴蟲自交第三代的表面抗原BspA樣蛋白有80％(8/10)同一性。噬菌體回收實驗顯示克隆MppZL4與脫尾童蟲的結合力顯著高于MppZL6，MppZL1;Western blot結果顯示，只有與MppZL4結合的成蟲膜蛋白中有一條特異性條帶，其大小為45.0 kDa;免疫組化染色結果表明:MppZL4可與S.j毛蚴脫尾童蟲、肺期童蟲、肝期童蟲及24天成蟲結合。
　　 結論:通過噬菌體展

7、示肽對活蟲體作體外差異親和淘選獲得的特異性M13噬菌體MppZL4，可在小鼠體內特異性地與S.j的童蟲和成蟲表膜結合。
　　 第二章 MppZL4及人工合成短肽ZL4的功能檢測
　　 目的:通過MppZL4及人工合成的ZL4在體內外對日本血吸蟲（S.j）的殺傷實驗，檢測ZL4的生物學功能，并從細胞水平上初步探討ZL4的作用機制。
　　 方法:洗脫回收率檢測MppZL4對S.j的靶向性:于小鼠感染S.j3 d、及1

8、0d后，分別尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15 min后剖殺小鼠，心臟灌注，取出肝肺，洗脫噬菌體測定豐度，設立空白對照及陰性對照組;于小鼠感染S.j24 d后，尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15min后剖殺小鼠，心臟灌注沖蟲，并取出肝肺，洗脫噬菌體測定豐度，同時洗脫蟲體噬菌體并計數。體外殺傷實驗檢測MppZL4對S.j脫尾童蟲的殺傷作用:無菌條件下MppZL4處理S.j脫尾童蟲，每24小時美藍染色后觀察一次，連續(xù)觀察

9、72 h，統(tǒng)計蟲體死亡率，設置陽性對照、陰性對照及空白對照組。小鼠感染S.j24 d后，尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15 min后剖殺小鼠取出蟲體，無菌條件下制備S.j細胞，作免疫細胞化學觀察MppZL4在細胞上的定位;體外培養(yǎng)MppZL4處理的S.j細胞1d后，MTT試劑盒檢測其抑制率，并利用公式計算IC50。人工合成羅丹明標記的ZL4短肽RhB-ZL4，同法體外檢測其對S.j童蟲的結合功能及殺傷功能，體內檢測其對S.j成

10、蟲的結合功能。
　　 結果:洗脫回收率檢測MppZL4噬菌體靶向性結果顯示:在感染小鼠體內，第3d時，肺組織MppZL4豐度為0.869±0.018，較高，而肝組織MppZL4豐度7.211±4.818，偏低;第10d則肺組織MppZL4豐度為0.239±0.065，較低，而肝組織MppZL4噬菌體豐度15.833±8.224，偏高;第24 d時，各組噬菌體洗脫數無明顯差異，但是蟲體MppZL4洗脫豐度17.256±9.588遠

11、高于M13KE洗脫豐度0.202±0.056。體外殺傷實驗觀察到MppZL4致死率高于東方田鼠血清陽性對照組(P=0.000);48 h后，其死亡率已達到100％。免疫細胞化學檢測結果顯示，MppZL4主要沉積于S.j大圓細胞、三角形細胞及不規(guī)則細胞的細胞膜上。MTT檢測細胞毒效應顯示，MppZL4濃度為1010 pfu時，即具有明顯的細胞毒性(P=0.000)，且隨著MppZL4濃度的增高，毒性效應增強;IC50≈1021。RhB-Z

12、L4檢測結果顯示:RhB-ZL4體外與能與脫尾童蟲體外特異性結合，其體外24hr及48hr致死率與MppZL4陽性對照組無顯著性差異，72hr后死亡率為100％;體內能與S.j成蟲特異性結合
　　 結論:MppZL4分子對血吸蟲作用具有靶向性和一定的拮抗性及細胞毒性;RhB-ZL4可與日本血吸蟲童蟲及成蟲特異性結合，對日本血吸蟲童蟲有一定的拮抗性。
　　 第三章 ZLW/pEGFP-C2質粒的構建及其功能鑒定
　　

13、 目的:觀察日本血吸蟲表膜特異結合肽合成基因構建的ZLW/pEGFP-C2質粒體外轉染Sj脫尾童蟲效率，了解其抗蟲作用。
　　 方法:構建ZLW/pEGFP-C2質粒，運用二甲基亞砜(DMSO)作用下的高濃度質粒浸泡技術，將ZLW/pEGFP-C2對機械轉化日本血吸蟲童蟲進行體外轉染，以瞬時表達的EGFP為陽性標記，在倒置熒光鏡下對蟲體進行觀察;轉染后童蟲培養(yǎng)48h，抽提蟲體總RNA和全蟲蛋白，分別用RT-PCR和Wester

14、n blot檢測ZLW基因和EGFP基因在童蟲體內的表達;轉染后蟲體繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72及96h不同時點用美蘭染色法鑒別蟲體死活并計數;上述實驗均設空質粒和正常童蟲作平行對照。
　　 結果:成功構建ZLW/pEGFP-C2質粒，經ZLW/pEGFP-C2質粒轉染的蟲體在鏡下觀察顯示有10％的轉染率，其EGFP主要位于蟲體皮層，以口、腹吸盤最為明顯;RT-PCR擴增出259 bp，片斷大小與預期相符，經測序與ZLW序列一致

15、;Western-blot證實EGFP基因在童蟲蟲體內有表達?？瓜x效果顯示，24及48h時，實驗組、對照組死亡率無明顯差異性(P24=0.600，P48=0.508);72h后，實驗組死亡率顯著高于對照組(P72=0.000);96h后實驗組死亡率達到100％。
　　 結論:成功構建ZLW/pEGFP-C2質粒，DMSO作用下的高濃度質粒浸泡技術成功地將ZLW/pEGFP-C2質粒引入日本血吸蟲童蟲體內并獲得表達;ZLW/pEG