TGF-b信號(hào)中TGF-bRⅡ的突變對(duì)膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景及目的：
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta 1（TGF-β1）信號(hào)通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體（TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ）途徑，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞常常通過(guò)TGF-β受體的下調(diào)或者突變，逃避TGF-β信號(hào)對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用。但是，TGF-β1 激活的信號(hào)還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙，具有促腫瘤的作用，這就是著名的TGF-β“雙向”作用。惡性腫瘤細(xì)胞如何逃避TGF-β信號(hào)的生長(zhǎng)阻滯作用，并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移能力，

2、其機(jī)制仍不完全清楚。本研究旨在探討TGF-ΒrⅡ的表達(dá)和分子狀態(tài)在膀胱癌腫瘤中的作用及其機(jī)制，以及與臨床關(guān)系及其意義，為以其為靶點(diǎn)的腫瘤干預(yù)策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.TGF-β1 及其TGF-β受體在多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)檢測(cè)
　　 1）應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各種腫瘤細(xì)胞系（乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，子宮頸癌，白血病，前列腺癌，黑色素瘤及膀胱癌細(xì)胞）中TGF-ΒrⅠ，TGF-ΒrⅡ，

3、TGF-β1的表達(dá)。
　　 2）應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87細(xì)胞表面TGF-ΒrⅡ的表達(dá)，胞漿中TGF-β1的表達(dá)。
　　 3）應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法（細(xì)胞爬片）檢測(cè)L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87細(xì)胞表面的TGF-ΒrⅡ的染色程度。
　　 2.L02，ScaBER和T24細(xì)胞中TGF-β信號(hào)的阻斷試驗(yàn)
　　 1）

4、將本室構(gòu)建的可溶性II 型TGF-β受體（Fc:TβRII；與TGF-ΒrⅡ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF-β1，阻斷TGF-β信號(hào)通路）轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中，應(yīng)用Western blot 方法檢測(cè)細(xì)胞上清中Fc:TβRII的表達(dá)。
　　 2）將Smad2/3的siRNA 轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，應(yīng)用抗Smad2/3 抗體，Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞中Smad2/3的表達(dá)。
　　 3.TGF-ΒrⅡ?qū)δ[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力影響的實(shí)驗(yàn)

5、>　　 1）用PKH-26 將目的細(xì)胞染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48 h后各組細(xì)胞的增殖水平（用刺激指數(shù)表示）。
　　 2）應(yīng)用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況，用蘇木素-伊紅染色后隨機(jī)選取五個(gè)視野計(jì)數(shù)分組：①對(duì)照組；②Fc:TβRII 轉(zhuǎn)染組；③TGF-β1 刺激組；④Si-Smad2/3組。
　　 4.膀胱癌細(xì)胞及組織標(biāo)本中TGF-ΒrⅡ序列測(cè)定，及其突變分析
　　 首先，針對(duì)TGF-Β

6、rⅡ編碼區(qū)第383-2086bp 設(shè)計(jì)TGF-ΒrⅡ的測(cè)序引物；應(yīng)用RT-PCR方法進(jìn)行TGF-ΒrⅡ基因擴(kuò)增；然后，利用瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收，純化；送至上海英駿公司進(jìn)行序列測(cè)定；利用pubmed中BLAST 將測(cè)序結(jié)果與TGF-ΒrⅡ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。
　　 5.檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中TGF-β1/TGF-ΒrⅡ信號(hào)激活的下游通路
　　 1）應(yīng)用Western blot 檢

7、測(cè)TGFβ經(jīng)典信號(hào)通路中的Smad 磷酸化形式pSmad 蛋白的表達(dá)。
　　 2）應(yīng)用IP（免疫共沉淀）檢測(cè)TGF-ΒrⅡ復(fù)合體與Smad的結(jié)合。
　　 3）在TGFβ1（2 ng/ml）刺激0 h，2 h和4 h 不同時(shí)間段，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)L02，ScaBER和T24細(xì)胞中增殖相關(guān)基因p15，細(xì)胞分裂周期蛋白Cdc25A及促遷移活性的轉(zhuǎn)錄因子CUTL1的表達(dá)。
　　 4）在TGFβ1（2 n

8、g/ml）刺激0 h，4 h和8 h 不同時(shí)間段，應(yīng)用Western blot 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 6.從膀胱癌標(biāo)本中分離原代細(xì)胞后，檢測(cè)TGFβ信號(hào)對(duì)TGF-ΒrⅡ突變?nèi)海╝）與未突變?nèi)海╞）生物學(xué)特性的影響
　　 1）從膀胱癌組織標(biāo)本中分離原代膀胱癌細(xì)胞。
　　 2）應(yīng)用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)a組和b組細(xì)胞表面TGF-ΒrⅡ的表達(dá)。
　　 3）利用FCM 檢測(cè)膀胱癌原代細(xì)胞的

9、增殖能力（SI）分組：①0 h 對(duì)照組；②24 h 對(duì)照組；③24 h 刺激組（TGF-β1）。
　　 4）利用Transwell 侵襲轉(zhuǎn)移試驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌原代細(xì)胞的活力和遷移能力；分組：①對(duì)照組；②TGF-β1 刺激組；③Fc:TβRII 轉(zhuǎn)染組。
　　 5）利用RT-PCR檢測(cè)TGF-β1 刺激0 h，2 h和4 h后，a,b 兩組中p15，Cdc25A和CUTL1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.TG

10、F-β1在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ在多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞表面低表達(dá)，僅僅在人類(lèi)膀胱癌細(xì)胞株T24表面，TGF-ΒrⅡ高表達(dá)，通過(guò)序列分析，在跨膜區(qū)的116 位，118 位，以及胞漿段269 位發(fā)生點(diǎn)突變；269 位的Ser/Thr 激酶域的G→A（Glu269 → Lys）點(diǎn)突變，致使蛋白質(zhì)變性，由酸性氨基酸轉(zhuǎn)換為堿性氨基酸。
　　 2.在TGF-β1 刺激下，IP 試驗(yàn)證明上述突變不影響TGF-Βr

11、Ⅱ與Smad2/3的結(jié)合，而且增殖試驗(yàn)結(jié)果表明TGF-ΒrⅡ的突變，反而解除了TGF-β1 信號(hào)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；Transwell 試驗(yàn)說(shuō)明發(fā)生點(diǎn)突變的TGF-ΒrⅡ/TGF-β信號(hào)能促?gòu)?qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力。
　　 3.進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR和Western blot 試驗(yàn)，對(duì)下游細(xì)胞增殖相關(guān)基因p15和Cdc25A 及動(dòng)力相關(guān)基因CUTL1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-ΒrⅡ突變體介導(dǎo)的信號(hào)途徑能下調(diào)p15的表達(dá)，上調(diào)Cdc

12、25A的表達(dá)，同時(shí)提高CUTL的表達(dá)，不抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.膀胱癌細(xì)胞系以及原代膀胱癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Fc:TβRII或Smad2/3的siRNA，TGF-β信號(hào)被阻斷；發(fā)生TGF-ΒrⅡ突變的癌細(xì)胞群中，p15和Cdc25A的表達(dá)無(wú)明顯變化，但CUTL1的表達(dá)明顯上調(diào)；
　　 5.在膀胱癌標(biāo)本中，TGF-ΒrⅡ基因發(fā)生的G→A 點(diǎn)突變（與膀胱癌細(xì)胞系T24中的TGF-ΒrⅡ

13、突變類(lèi)型一致）比例高達(dá)39.1％，與膀胱癌臨床分期中的T2級(jí)（P=0.007，＜0.01）以及病理分級(jí)的高級(jí)別瘤（P=0.003，＜0.01）密切相關(guān)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)TGF-ΒrⅡ在膀胱癌細(xì)胞系中的點(diǎn)突變，與膀胱移行上皮癌T24的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并在高轉(zhuǎn)移，高侵襲的膀胱癌病人的腫瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)同樣的突變類(lèi)型，說(shuō)明TGF-ΒrⅡ的點(diǎn)突變很可能為膀胱癌轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，這為T(mén)GF-β1 信號(hào)在腫瘤發(fā)生中的所發(fā)揮的調(diào)節(jié)