SCF-c-Kit信號對膀胱癌T24細胞侵襲遷移的影響及其相關(guān)機制的研究.pdf

1、背景：膀胱癌的發(fā)生在惡性泌尿系腫瘤中較為多見，其高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率一直是人們關(guān)注的焦點。c-Kit是Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族的重要成員，在多種細胞中都有表達，其與配體干細胞因子（SCF）結(jié)合，參與調(diào)控細胞的增殖、存活、分化和遷移等過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，SCF/c-Kit信號在胰腺癌、大腸癌和人類黑色素瘤等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面具有重要作用，但具體的作用機制及其是否同樣在膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用的研究報道卻很少。文獻顯示，β-連環(huán)蛋白（β

2、-catenin）信號通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，其中β-catenin的胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移是該信號經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的標志。最近的研究報道表明β-catenin信號也參與了膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此探討SCF/c-Kit信號在膀胱癌細胞侵襲遷移方面具有什么樣的作用及其與β-catenin信號之間有什么樣的關(guān)系，對全面了解膀胱癌浸潤、轉(zhuǎn)移的機制具有重要意義。
　　目的：探討SCF/c-Kit信號對膀胱癌T24細胞侵襲遷移的影響

3、及其相關(guān)機制。
　　方法：⑴采用Western blot和流式細胞術(shù)（FCM）檢測T24細胞c-Kit的表達。⑵通過細胞遷移實驗（劃痕實驗）觀察T24細胞在經(jīng)過SCF（1 ng/mL）刺激24h后，其遷移能力的變化。⑶收集經(jīng)過SCF（1 ng/mL）單獨刺激24h，或分別使用c-kit抑制劑Imatinib（100 nM）、PI3K-Akt信號通路特異性抑制劑Wortmannin（1μM）、MAPK激酶MEK的高效選擇性抑制劑U0

4、126（10μM）、STAT3通路特異性抑制劑JSI-124（5μM）和β-catenin信號抑制劑XAV-939（10 nM）預(yù)處理40min，再用SCF（1 ng/mL）刺激24h后的T24細胞，進行 Transwell侵襲實驗（直接與間接計數(shù)法），觀察T24細胞侵襲性的變化。⑷Western blot檢測T24細胞在SCF（1 ng/mL）單獨刺激或先使用PI3K-Akt信號通路特異性抑制劑Wortmannin（1μM）預(yù)處理40

5、 min，再用SCF（1 ng/mL）刺激后Akt磷酸化情況。⑸采用免疫熒光化學(xué)技術(shù)，運用激光共聚焦顯微鏡觀察 T24細胞經(jīng)過 SCF（1ng/mL）刺激不同時間后，β-catenin在細胞中的定位及其動態(tài)變化。⑹Western blot檢測T24細胞在使用GSK-3β抑制劑Staurosporine(5 nM)或LiCl(10 mM)處理24 h后，β-catenin總蛋白和胞漿蛋白的表達情況，以明確T24細胞中是否存在GSK-3β對

6、β-catenin的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：①T24細胞中存在c-Kit的表達，其中12％的T24細胞表面存在c-Kit受體的表達。②T24細胞經(jīng)SCF（1 ng/mL）作用24 h后，遷移能力（75.42%）與對照組相比（38.99%）明顯提高（P＜0.01）。③Transwell侵襲實驗（直接與間接計數(shù)法）的結(jié)果表明：與對照組（細胞數(shù)和OD值：26.25±0.96，0.096±0.004）相比，SCF單刺激組（細胞數(shù)和OD值：4

7、7.25±1.71，0.119±0.006）細胞侵襲能力明顯提高（P＜0.01）；Imatinib（100 nM）+SCF（1 ng/mL）組（細胞數(shù)和OD值：26.75±0.96，0.091±0.012）、Wortmannin（1μM）+SCF（1 ng/mL）組（26±2.16，0.096±0.004）和XAV-939（10 nM）+SCF（1 ng/mL）組（細胞數(shù)和OD值：26±0.82，0.103±0.002）與SCF單刺激組

8、相比侵襲能力則明顯降低（P＜0.01）；而U0126（10μM）+SCF（1 ng/mL）組（細胞數(shù)和OD值：46.75±2.63，0.115±0.002）和JSI-124（5μM）+SCF（1 ng/mL）組（細胞數(shù)和OD值：47.75±2.99，0.114±0.004）的細胞侵襲能力與SCF單刺激組相比并無明顯差異（P＞0.05）。④T24細胞經(jīng)SCF（1 ng/mL）刺激后，與對照組相比出現(xiàn)了明顯的磷酸化Akt條帶(P<0.01)

9、，而使用特異性抑制劑Wortmannin（1μM）預(yù)處理40 min后再用SCF（1 ng/mL）刺激的T24細胞磷酸化 Akt條帶與 SCF單刺激組相比明顯減弱(P<0.01)。⑤與對照組相比，T24細胞受SCF（1 ng/mL）刺激不同時間后，β-catenin在細胞內(nèi)的分布情況有所不同：對照組（SCF刺激0 h時），T24細胞膜表面均勻分布細小顆粒狀綠色熒光；SCF刺激30 min后，可見顆粒狀綠色熒光呈彌漫性分布于胞漿內(nèi)；SCF

10、刺激1 h后，可見胞核內(nèi)的綠色點狀熒光明顯增多，說明隨著SCF刺激時間的變化，細胞內(nèi)的β-catenin有從胞漿內(nèi)向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的趨勢。⑥運用GSK-3β抑制劑Staurosporine(5 nM)、LiCl(10 mM)處理T24細胞后，細胞內(nèi)的β-catenin總蛋白及胞漿蛋白的表達量均明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：⑴SCF/c-Kit信號通過啟動下游的PI3K-Akt途徑促進T24細胞的侵襲遷移；⑵SCF也可以通過激活