IL-6-STAT3-TFF3信號通路調(diào)控EMT對移植肝膽管纖維化的影響.pdf

1、背景與目的:
　　非吻合性膽管狹窄(non-anastomotic biliary stricture,NABS)是目前肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要類型,其病理基礎(chǔ)是膽管上皮損傷后局部異常修復(fù)所致的移植肝膽管纖維化。研究發(fā)現(xiàn),冷保存再灌注損傷(cold preservation reperfusion injury,CPRI)是移植肝膽管纖維化發(fā)生的獨立影響因素,但其發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。新近研究發(fā)現(xiàn),膽管上皮細(xì)胞(biliary

2、 epithelial cell,BEC)可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)成為肝膽管纖維化過程中基質(zhì)生成細(xì)胞的主要異質(zhì)性來源。EMT指上皮細(xì)胞在特定條件下逐漸獲取失去其表型,同時獲取間質(zhì)細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)化過程,在胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移及創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。研究證實,腎小管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞EMT分別是腎臟和肺臟纖維化形成的重要機(jī)制。而在原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽

3、管炎發(fā)病機(jī)制中,BEC EMT是導(dǎo)致肝膽道纖維化的關(guān)鍵因素。體外實驗業(yè)已證實,成熟的BEC可在細(xì)胞因子/促炎因子刺激下發(fā)生EMT,動物實驗中也同樣觀察到了大鼠移植肝BEC EMT現(xiàn)象。以上研究結(jié)果提示:BEC EMT很可能參與了CPRI導(dǎo)致的移植肝膽管纖維化過程。
　　CPRI是肝移植術(shù)中不可避免的病理過程,而IL-6則是其作用于BEC的主要效應(yīng)介質(zhì)。正常情況下,BEC低表達(dá)IL-6,在損傷因素的作用下可誘導(dǎo)IL-6高表達(dá),通過結(jié)

4、合其在BEC上的受體gp130激活STAT3磷酸化。研究發(fā)現(xiàn),IL-6/STAT3信號通路的活化與膽管上皮細(xì)胞的增殖、修復(fù)及屏障功能密切相關(guān),而IL-6-/-的小鼠則因喪失上皮修復(fù)及屏障功能而導(dǎo)致膽管樹完整性破壞。既往研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)CPRI或rhIL-6處理受體大鼠后,可致移植肝BEC內(nèi)STAT3磷酸化,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖;同時,隨著冷保存時間的延長或rhIL-6劑量的增加,還觀察到管周肌纖維母細(xì)胞聚集和膠原沉積現(xiàn)象,BEC同時表達(dá)膽管上皮

5、和間質(zhì)兩種標(biāo)志物。研究結(jié)果提示:CPRI可能通過活化IL-6/STAT3,誘導(dǎo)BEC發(fā)生EMT,進(jìn)而成為移植肝膽管纖維化中基質(zhì)生成細(xì)胞的主要來源。
　　三葉因子3(trefoil factor family3,TFF3)是近年來研究較多的一種小分子多肽,屬三葉因子家族,其在胃腸道上皮的損傷修復(fù)過程中起重要作用。新近研究表明,TFF3在IL-6/STAT3信號通路的調(diào)控下,通過增強(qiáng)BEC移行能力,參與了膽管上皮的損傷修復(fù)。鑒于TFF

6、3主要高表達(dá)于肝門區(qū)及肝內(nèi)大膽管,與肝移植術(shù)后NABS的病變部位一致,因此,TFF3很可能在CPRI誘導(dǎo)的BEC EMT及移植肝膽管纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　基于以上理論基礎(chǔ)及研究結(jié)果,我們推測:CPRI通過激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路,從而誘導(dǎo)BEC EMT,且TFF3作為該信號通路下游因子,對BEC EMT發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究旨在闡明IL-6/STAT3/TFF3信號通路在CPRI誘導(dǎo)BEC EMT過程中的作

7、用及機(jī)制,研究結(jié)果有望進(jìn)一步闡明移植肝膽管纖維化的發(fā)病機(jī)制,同時為臨床肝移植術(shù)后NABS的防治提供新的靶點。
　　方法:
　　1.收集我院自2002年11月至2011年1月因NABS行再次肝移植患者的病肝標(biāo)本,經(jīng)初步篩選后行免疫組織化學(xué)染色,觀察上皮標(biāo)志物(CK19、E-cadherin)及間質(zhì)標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)在病肝BEC中的表達(dá)情況,同時明確TFF3在上述部位是否表達(dá)。
　　2.體外培養(yǎng)hBEC

8、并建立CPRI的細(xì)胞模型,通過QRT-PCR和WB檢測IL-6/STAT3/TFF3信號通路各因子及上皮標(biāo)志物(CK19、E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)在BEC中的mRNA/蛋白表達(dá)情況;利用rhIL-6、IL-6中和性抗體、STAT3磷酸化特異性抑制劑STATTIC、轉(zhuǎn)染TFF3siRNA、rhTFF3分別上調(diào)、下調(diào)該信號通路各因子,觀察相應(yīng)下游因子及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化;制備的TFF3腺病毒

9、載體并轉(zhuǎn)染hBEC,通過細(xì)胞劃痕實驗觀察TFF3對hBEC遷移能力的直接影響。
　　3.通過建立重建肝動脈的SD大鼠原位肝移植模型在真實病理狀態(tài)下進(jìn)一步驗證CPRI對BEC的作用。分別設(shè)定不同的供肝冷保存時間(1h、6h、12h),于術(shù)后不同時相點(1d,3d,7d,14d)采集標(biāo)本,對包含對照組共計16個組別(n=5)的大鼠移植肝膽管組織進(jìn)行QRT-PCR及WB檢測,明確IL-6/STAT3/TFF3信號通路各因子及上皮標(biāo)志物(

10、CK19、E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)在BEC中的mRNA/蛋白表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織化學(xué)染色顯示:患者病肝BEC在表達(dá)上皮標(biāo)志物(CK19、E-cadherin)的同時,還表達(dá)了間質(zhì)標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin),而TFF3也在上述部位高表達(dá)。結(jié)果提示移植肝膽管BEC的確發(fā)生了EMT,TFF3可能參與這一過程的調(diào)控。
　　2. QRT-PCR及WB結(jié)

11、果顯示,體外模擬CPRI或加入rhIL-6均可引起IL-6/STAT3/TFF3在hBEC中的表達(dá)顯著上調(diào),同時其CK19、E-cadherin表達(dá)下調(diào),伴隨a-SMA、Vimentin表達(dá)上調(diào);分別應(yīng)用中和性IL-6抗體、STATTIC、TFF3siRNA阻斷該信號通路后可明顯抑制CPRI的作用;而加入rhTFF3對BEC EMT具有直接誘導(dǎo)作用;此外,感染TFF3腺病毒的hBEC移行能力明顯增強(qiáng)。結(jié)果提示CPRI通過活化IL-6/S

12、TAT3信號通路,上調(diào)TFF3表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)BEC EMT,且TFF3對BEC EMT具有關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　3. QRT-PCR結(jié)果顯示,大鼠移植肝BEC表達(dá)IL-6及TFF3 mRNA明顯上調(diào),同時CK19、E-cadherin表達(dá)下調(diào),伴隨a-SMA、Vimentin表達(dá)上調(diào),表達(dá)差異隨供肝冷保存時間的延長而愈加顯著;WB結(jié)果顯示移植肝BEC中各蛋白表達(dá)變化與mRNA一致,在此過程中p-STAT3表達(dá)亦逐漸上調(diào)。結(jié)果提示大鼠