TFF3-Twist信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-10的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腸三葉因子TFF3主要表達(dá)在胃腸道上皮，由杯狀細(xì)胞分泌，其主要生理作用是保護(hù)和重建腸道上皮，維持腸上皮細(xì)胞屏障的完整性。在胃腸道組織發(fā)生慢性炎癥時(shí)，TFF3異常表達(dá)。新近發(fā)現(xiàn)，TFF3與腫瘤有一定關(guān)系，它能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，與結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞間粘連破壞，腫瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL-10在炎癥、惡性腫瘤和自身免疫性疾病均發(fā)揮重要作用。但在腸組織中TFF3和IL-10的關(guān)系尚不清楚。我們報(bào)道了

2、TFF3能誘導(dǎo)MEK表達(dá)，而文獻(xiàn)提示ERK通路的活化與IL-10的表達(dá)有密切的關(guān)系，因此，我們推測(cè)TFF3可能參與IL-10調(diào)節(jié)，并且在炎癥相關(guān)的腫瘤中起著重要作用。我們小組前期研究發(fā)現(xiàn)TFF3能夠上調(diào)Twist表達(dá)，受到國(guó)際業(yè)界專(zhuān)家的專(zhuān)章評(píng)論文章的高度認(rèn)可，近期，Dr.Dafna在Cancer Cell將我們TFF3-Twist信號(hào)歸納為重要的Twist介導(dǎo)的腫瘤信號(hào)通路之一。Twist是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前已在

3、多種人類(lèi)上皮來(lái)源腫瘤中發(fā)現(xiàn)Twist高表達(dá)，同時(shí)研究認(rèn)為T(mén)wist是一種癌基因，能夠編碼凋亡抑制蛋白，與EMT及惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Twist作為白介素的轉(zhuǎn)錄因子p65的負(fù)調(diào)節(jié)子，是否參與TFF3介導(dǎo)的IL調(diào)節(jié)尚不清楚。我們的研究中還發(fā)現(xiàn)ARR2受到TFF3調(diào)節(jié)，ARR2有一個(gè)核輸出信號(hào)(NES)，游離的ARR2被細(xì)胞核排除，但是否ARR2參與TFF3誘導(dǎo)的IL-10及其具體機(jī)制并不清楚。本研究意在探討TFF3通

4、過(guò)ARR2/ERK/Twist通路調(diào)節(jié)IL-10這一過(guò)程的具體機(jī)制，為炎癥相關(guān)腫瘤的研究提供新證據(jù)。
　　方法：
　　一、構(gòu)建實(shí)驗(yàn)相關(guān)表達(dá)載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
　　1、分子克隆技術(shù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)相關(guān)表達(dá)載體。
　　2、慢病毒感染IEC細(xì)胞建立過(guò)表達(dá)TFF3及干擾Twist穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　二、驗(yàn)證Twist介導(dǎo)TFF3調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)
　　1、RT-PCR和Western Blot方法驗(yàn)證TFF3調(diào)節(jié)IL-

5、10表達(dá)。
　　2、結(jié)合RNA干擾技術(shù)，RT-PCR和Western Blot方法驗(yàn)證Twist在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平調(diào)節(jié)IL-10表達(dá)作用。
　　3、ELISA技術(shù)檢測(cè)Twist介導(dǎo)的TFF3調(diào)節(jié)IL-10的分泌水平。
　　三、確認(rèn)TFF3通過(guò)ERK1/2調(diào)節(jié)Twist表達(dá)
　　1、Western Blot分析檢測(cè)高表達(dá)TFF3的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中，ERK1/2磷酸化水平的變化。
　　2、激光掃描共聚焦技

6、術(shù)結(jié)合Western Blot檢測(cè)TFF3誘導(dǎo)p-ERK1/2核質(zhì)異位。
　　3、RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證TFF3通過(guò)ERK1/2調(diào)節(jié)Twist表達(dá)。
　　4、免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)TFF3調(diào)節(jié)ERK1/2與Twist相互作用。
　　四、檢測(cè)ARR2參與調(diào)節(jié)p-ERK1/2與Twist的互作關(guān)系
　　1、免疫共沉淀方法檢測(cè)高表達(dá)TFF3情況下ARR2與p-ERK1/2的相互作用。
　　2、免疫共沉淀方法檢測(cè)ARR2調(diào)

7、節(jié)p-ERK1/2與Twist的相互作用。
　　3、激光掃描共聚焦技術(shù)結(jié)合Western Blot檢測(cè)ARR2誘導(dǎo)p-ERK1/2核質(zhì)異位。
　　五、驗(yàn)證Twist負(fù)調(diào)節(jié)p-ERK1/2
　　RNA干擾技術(shù)及Western Blot技術(shù)檢測(cè)Twist對(duì)p-ERK1/2的負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　一、成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)相關(guān)質(zhì)粒及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　1、成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-TFF3、pcDN

8、A3.1/HisA-Tab1、pcDNA3.0/Flag-ERK1、pcDNA3.0/Flag-ERK2、pEGFP-N1-ERK1、pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ERK1、pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ARR1、 pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ARR2及原核表達(dá)載體pGEX-5x-1-ARR2。
　　2、成功建立慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)TFF3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及干擾Twist穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　

9、二、證實(shí)Twist介導(dǎo)TFF3調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)
　　1、TFF3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)IL-10表達(dá)。
　　2、Twist在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)IL-10表達(dá)并在干擾Twist后IL-10表達(dá)減少。
　　3、ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)TFF3通過(guò)Twist調(diào)節(jié)IL-10的分泌。
　　三、明確TFF3通過(guò)ERK1/2調(diào)節(jié)Twist表達(dá)
　　1、高表達(dá)TFF3使ERK1/2磷酸化水平增強(qiáng)。
　　2、TFF3誘導(dǎo)p

10、-ERK1/2出核。
　　3、TFF3通過(guò)ERK1/2調(diào)節(jié)Twist表達(dá)。
　　4、高表達(dá)TFF3，ERK1/2與Twist相互作用減弱。
　　四、確認(rèn)ARR2參與調(diào)節(jié)p-ERK1/2與Twist的互作關(guān)系
　　1、高表達(dá)TFF3增強(qiáng)，ARR2與p-ERK1/2的相互作用。
　　2、ARR2調(diào)節(jié)p-ERK1/2與Twist的相互作用減弱。
　　3、ARR2誘導(dǎo)p-ERK1/2出核。
　　五、發(fā)現(xiàn)