人CD11clowCD45RBhigh調(diào)節(jié)性DC的培養(yǎng)及鑒定和人源化CML小鼠模型的建立.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)正常人骨髓來源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(DCregs)并從其細胞形態(tài)、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴細胞增殖能力等方面對其進行鑒定。
　　方法：1.分離正常人骨髓單個核細胞，分別接種到含有不同的細胞因子的1640培養(yǎng)基中，接種密度為3×106/瓶，培養(yǎng)不同種類的樹突狀細胞(DCs)，并分別用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察比較不同組別DCs的形態(tài)，流式細胞儀檢測其免疫表型以及DCs的吞

2、噬能力，在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)3d、4d、Sd后，通過CCK-8法檢測不同DCs刺激異基因淋巴細胞增殖能力。2.實驗分組如下：①A組：DCregs組，含GM-CSF20 ng/mL，IL-1020 ng/mL，TGF-β120 ng/mL的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，并用脂多糖(LPS)刺激24 h使其成熟。②B組：未成熟DCs(imDCs)組，用含GM-CSF20 ng/mL，IL-410 ng/mL1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d；③C組：成熟

3、DCs(mDCs)組，用含GM-CSF20 ng/mL，IL-410 ng/mL的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，予LPS刺激24 h，使其成熟。
　　結(jié)果：1.正常人骨髓單個核細胞在培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長，僅見少量懸浮細胞，約4d左右出現(xiàn)半黏附細胞團，細胞團逐漸增多、變大，5d時細胞表面出現(xiàn)長短不一毛刺樣突起；培養(yǎng)8d的DCs電鏡下可看到密集的樹突分布在細胞周圍；2.流式細胞儀檢測：DCregs組和imDCs組HLA-DR和CD8

4、0、CD86分子低表達，mDCs組高表達HLA-DR、CD80、CD86分子，imDCs組經(jīng)LPS刺激后CD80、CD86及HLA-DR表達均上調(diào)，DCregs組經(jīng)LPS刺激后CD80、CD86及HLA-DR表達無明顯變化，DCregs組與imDCs組、mDCs組相比高表達CD45RB，低表達CD11c。3.流式細胞儀檢測DCs的吞噬FITC-Dextran能力顯示，DCregs組、imDCs組的平均熒光強度明顯高于mDCs組，差異有統(tǒng)

5、計學(xué)意義(P<0.05)，而DCregs組與imDCs組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4.體外混合淋巴細胞培養(yǎng)中淋巴細胞增殖能力結(jié)果顯示，DCregs組、imDCs組增殖率明顯低于mDCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而DCregs組增殖率最低(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.入骨髓源單個核細胞在聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF、IL-10和TGF-β1培養(yǎng)8d后獲得的細胞形態(tài)具有調(diào)節(jié)性DCs的典型特征和免疫表型，說明該實

6、驗建立的培養(yǎng)調(diào)節(jié)性DCs的方法是切實可行的。2.CD11clowCD45RBhighDCregs這種新亞群具有較強的吞噬能力，刺激T淋巴細胞的增殖能力較弱，為調(diào)節(jié)性DCs誘導(dǎo)免疫耐受的進一步研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　目的：構(gòu)建人源化BALB/c裸鼠慢性粒細胞白血病(CML)模型，為CML各種治療手段的研究提供實驗用動物模型。
　　方法：1、BALB/c裸鼠預(yù)處理：將4周齡BALB/c裸鼠在無菌條件下行脾切除術(shù)，環(huán)磷酰胺腹腔注射

7、及全身亞致死量照射預(yù)處理(SCI預(yù)處理)。2、細胞準(zhǔn)備：分離初診的CML患者的骨髓單個核細胞，以無菌的PBS調(diào)整濃度15×107/mL，即4.5×107個/0.3mL。3、細胞接種：將人的單個核細胞，通過尾靜脈注入SCI預(yù)處理過的裸鼠體內(nèi)(4.5×107個/只)。實驗分組：A組：單純預(yù)處理組，對裸鼠進行SCI預(yù)處理后，經(jīng)尾靜脈注入0.3 mL的PBS；B組：白血病細胞接種組，接種細胞為CML患者骨髓單個核細胞。4、觀察裸鼠的體重、飲食變

8、化，裸鼠經(jīng)預(yù)處理后體重明顯下降，當(dāng)體重漸增至正常再次出現(xiàn)消瘦時開始尾靜脈取血，觀察血象及細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測人CD13、CD45的表達，將惡病質(zhì)裸鼠處死取骨髓病理學(xué)檢查及RT-PCR檢測bcr/abl融合基因。
　　結(jié)果：1、CML細胞接種組的裸鼠靜脈輸注人的單個核細胞后，隨著時間的延長，裸鼠會出現(xiàn)不同程度的活動度減低，食量下降，消瘦，脊背拱起，最后出現(xiàn)惡病質(zhì)而死亡。生存時間為46±4.2 d(45～57 d)。2、人CD13

9、、CD45抗原細胞的表達：白血病接種組，第3周檢測到外周血CD13和CD45雙陽性的細胞占2.56％±0.36%，第6周占4.97%±0.43%，兩個時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而單純預(yù)處理組第3周和第6周分別為0.56%±0.05%，0.44%±0.07%，兩個時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3、裸鼠經(jīng)過接種白血病細胞后，第3周的血片可以觀察到原始細胞，比例為2.6±0.9%(1%～4%)，病程后期，裸鼠處