大腸桿菌產(chǎn)1，3丙二醇工業(yè)化菌株的構(gòu)建及調(diào)控.pdf

1、1，3-丙二醇英文縮寫(xiě)為1，3-PDO。是無(wú)色、無(wú)味的粘稠液體?？扇苡谒⒋?、醚等多種有機(jī)溶劑。主要用于增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化劑的合成，也用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。其最主要的用途是合成苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT較PET(聚對(duì)苯二甲酸乙二酯)、PBT(聚對(duì)苯二甲酸丁二酯)具有更優(yōu)良的性能，兼具PET的高性能和PBT的易加工性，具有廣闊的應(yīng)用前景，是目前合成纖維新品種開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。目前用化學(xué)方法合成1，3-PD成本較高，設(shè)備

2、投資大，技術(shù)難度高，產(chǎn)品分離純化困難，特別是催化劑的制備較難，且產(chǎn)生CO等污染環(huán)境的廢氣。與化學(xué)合成方法相比，微生物生產(chǎn)1，3-PD具有生產(chǎn)成本低、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。其纖維比普通纖維長(zhǎng)15％，而且是生物可降解纖維。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究證明由葡萄糖一步法合成1，3-PD是可行的，現(xiàn)在利用代謝調(diào)控和微生物發(fā)酵優(yōu)化的方法構(gòu)建可用于工業(yè)生產(chǎn)的基因工程菌。 已發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母(Saccharamces cerevisi

3、ae)中存在甘油合成途徑。當(dāng)環(huán)境滲透壓升高時(shí)，S.cerevisiae將啟動(dòng)高滲甘油應(yīng)答途徑(the high osmolarity glycerolresponse pathway,HOG途徑)，通過(guò)合成并在胞內(nèi)累積甘油以便維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)和3-磷酸甘油磷酸化酶(GPP2)是甘油合成途徑中的關(guān)鍵酶。目前發(fā)現(xiàn)能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的自然菌株如克雷伯肺炎桿菌(Klebsiella pn

4、eumoniae)、丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)、弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)、乳酸桿菌等(Lactobacilli)，其中以克雷伯肺炎桿菌和丁酸梭菌有較高的甘油耐受率和1，3-丙二醇得率。由于肺炎桿菌中1，3-丙二醇合成途徑已研究的較為明白，且其生化特性與大腸桿菌(Ecoli)非常接近，這就為菌種的基因改良和利用基因工程技術(shù)構(gòu)建新的菌種提供了便利，故選擇肺炎桿菌中1，3-丙

5、二醇合成酶的基因作為在大腸桿菌中異源表達(dá)合成1，3-丙二醇酶的基因。克雷伯氏肺炎桿菌是兼性厭氧菌，在以甘油為底物和厭氧環(huán)境下啟動(dòng)1，3-PD合成系統(tǒng)dha途徑。合成1，3-丙二醇有兩個(gè)關(guān)鍵酶，甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶，近來(lái)自大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)1，3-丙二醇氧化還原酶的同工酶，由基因vqhD編碼。 本研究從釀酒酵母中克隆GPD1和GPP2基因，構(gòu)建由單個(gè)啟動(dòng)子控制兩個(gè)基因表達(dá)的多順?lè)醋淤|(zhì)粒；從肺炎桿菌中克隆dhaB和dha

6、T基因(或者yqhD)基因)，構(gòu)建由同一啟動(dòng)子控制多個(gè)基因表達(dá)的重組質(zhì)粒，然后將這兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌由葡萄糖直接發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的策略。在此基礎(chǔ)上，我們從代謝調(diào)控和微生物發(fā)酵優(yōu)化的角度，分別在質(zhì)粒改造，同工酶，菌種優(yōu)化，代謝途徑改造等幾個(gè)方面對(duì)構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行了優(yōu)化，最終我們構(gòu)建了一種不需要昂貴的誘導(dǎo)劑而產(chǎn)量卻更高的微生物發(fā)酵體系，這使1，3-丙二醇的微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)向前邁進(jìn)了一大步。本實(shí)驗(yàn)的