大腸桿菌產1，3丙二醇工業(yè)化菌株的構建及調控.pdf

1、1，3-丙二醇英文縮寫為1，3-PDO。是無色、無味的粘稠液體?？扇苡谒?、醇、醚等多種有機溶劑。主要用于增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化劑的合成，也用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。其最主要的用途是合成苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT較PET(聚對苯二甲酸乙二酯)、PBT(聚對苯二甲酸丁二酯)具有更優(yōu)良的性能，兼具PET的高性能和PBT的易加工性，具有廣闊的應用前景，是目前合成纖維新品種開發(fā)的熱點。目前用化學方法合成1，3-PD成本較高，設備

2、投資大，技術難度高，產品分離純化困難，特別是催化劑的制備較難，且產生CO等污染環(huán)境的廢氣。與化學合成方法相比，微生物生產1，3-PD具有生產成本低、轉化率高、產物分離簡單、無環(huán)境污染等優(yōu)點。其纖維比普通纖維長15％，而且是生物可降解纖維。本實驗室之前的研究證明由葡萄糖一步法合成1，3-PD是可行的，現在利用代謝調控和微生物發(fā)酵優(yōu)化的方法構建可用于工業(yè)生產的基因工程菌。 已發(fā)現在釀酒酵母(Saccharamces cerevisi

3、ae)中存在甘油合成途徑。當環(huán)境滲透壓升高時，S.cerevisiae將啟動高滲甘油應答途徑(the high osmolarity glycerolresponse pathway,HOG途徑)，通過合成并在胞內累積甘油以便維持細胞內外滲透壓的平衡。3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)和3-磷酸甘油磷酸化酶(GPP2)是甘油合成途徑中的關鍵酶。目前發(fā)現能以甘油為底物發(fā)酵生產1，3-丙二醇的自然菌株如克雷伯肺炎桿菌(Klebsiella pn

4、eumoniae)、丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)、弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)、乳酸桿菌等(Lactobacilli)，其中以克雷伯肺炎桿菌和丁酸梭菌有較高的甘油耐受率和1，3-丙二醇得率。由于肺炎桿菌中1，3-丙二醇合成途徑已研究的較為明白，且其生化特性與大腸桿菌(Ecoli)非常接近，這就為菌種的基因改良和利用基因工程技術構建新的菌種提供了便利，故選擇肺炎桿菌中1，3-丙

5、二醇合成酶的基因作為在大腸桿菌中異源表達合成1，3-丙二醇酶的基因。克雷伯氏肺炎桿菌是兼性厭氧菌，在以甘油為底物和厭氧環(huán)境下啟動1，3-PD合成系統(tǒng)dha途徑。合成1，3-丙二醇有兩個關鍵酶，甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶，近來自大腸桿菌中發(fā)現1，3-丙二醇氧化還原酶的同工酶，由基因vqhD編碼。 本研究從釀酒酵母中克隆GPD1和GPP2基因，構建由單個啟動子控制兩個基因表達的多順反子質粒；從肺炎桿菌中克隆dhaB和dha

6、T基因(或者yqhD)基因)，構建由同一啟動子控制多個基因表達的重組質粒，然后將這兩個重組質粒共轉化導入大腸桿菌，成功實現了大腸桿菌由葡萄糖直接發(fā)酵生產1，3-丙二醇的策略。在此基礎上，我們從代謝調控和微生物發(fā)酵優(yōu)化的角度，分別在質粒改造，同工酶，菌種優(yōu)化，代謝途徑改造等幾個方面對構建的基因工程菌進行了優(yōu)化，最終我們構建了一種不需要昂貴的誘導劑而產量卻更高的微生物發(fā)酵體系，這使1，3-丙二醇的微生物發(fā)酵工業(yè)生產向前邁進了一大步。本實驗的