SHIV-XJ02170感染恒河猴后期傳代特點及其感染性克隆構(gòu)建和生物活性分析.pdf

1、在艾滋病的相關(guān)研究中,各種SHIV嵌合病毒及其動物感染模型得到了廣泛的應(yīng)用。HIV B'/C亞型作為我國主要流行株之一,是疫苗研制的主要靶株,然而迄今為止,尚未出現(xiàn)有較強感染力、能引起中國恒河猴出現(xiàn)艾滋癥狀的此類SHIV。因此,構(gòu)建或獲得動物適應(yīng)增強感染毒株,是建立針對性動物模型的關(guān)鍵。SHIV-XJ02170毒株,是以致病性B亞型強毒株SHIV-KB9為骨架,攜帶了B'/C重組亞型HIV-1中國流行株的env基因。在前期研究中,雖然通

2、過一系列的猴體傳代,并未出現(xiàn)致病性強毒株,但是傳代猴A0408體內(nèi)的病毒在猴體長期適應(yīng)和傳代過程中,毒力有增強的趨勢。env基因的變異分析也發(fā)現(xiàn),病毒的基因距離出現(xiàn)明顯擴大過程,且依照傳代的順序發(fā)生連續(xù)的基因進化。
　　 本研究是在此工作基礎(chǔ)上,針對A0408(本實驗編號G0401V)體內(nèi)長期適應(yīng)后已變異的SHIV-XJ02170病毒,進一步開展猴體傳代和CD8+T細胞剔除研究,分析該病毒在動物感染后期的傳代特點及其env基因的

3、變異情況,構(gòu)建出感染性全長克隆,并分別在細胞水平和猴體水平評價其活性。以期得到一株攜帶中國HIV-1流行株B'/C亞型基因、能感染中國恒河猴后誘發(fā)類艾滋癥狀的高致病性SHIV,并且在分子水平上探討病毒毒力增強的機制。
　　 將感染中國恒河猴G0401V后期(5年)的SHIV-XJ02170病毒垂直傳代2只猴(G0401V→G0402V→G0403V),同時,剔除G0401V猴體內(nèi)的CD8+T細胞使?jié)摲牟《敬罅繌?fù)制后傳代1只猴(

4、G0401V→G0404V),應(yīng)用流式細胞術(shù)、病毒載量測定、序列分析等方法研究該病毒在猴體內(nèi)長期適應(yīng)后的病毒學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)及序列變異特點。結(jié)果表明,G0401V在感染后期仍能穩(wěn)定傳代,且表現(xiàn)出病毒毒力增強的特點。其傳代猴G0402V在傳代后41d死亡,外周血CD4+T淋巴細胞衰竭,僅為43個/uL,符合艾滋病感染猴快速進展型的特征。剔除G0401 V體內(nèi)CD8+T細胞之后的傳代猴G0404V的表現(xiàn)類似G0401V,即長期低水平的病毒血癥

5、水平。env基因序列分析發(fā)現(xiàn)SHIV-XJ02170在G0401V體內(nèi)長期適應(yīng)后發(fā)生了變異,并且各傳代猴中發(fā)生了不同進化方向的變異,均伴隨糖基化位點的改變。
　　 為了進一步了解病毒基因改變對毒力的影響,以及獲得發(fā)生變異后毒力增強的毒株,又進行了感染性克隆的構(gòu)建等后續(xù)研究。首先構(gòu)建出以pCI-SphⅠ vector為載體、包含SHIV-KB9病毒全基因組的pSHIV-KB9-pCI全長克隆作為克隆骨架,以及包含SHIV-KB9病

6、毒3’端半長基因組的pSHIV-KB9-Eco47Ⅲ-3’半長克隆用于env基因的替換。從代表了SHIV-XJ02170病毒兩種變異方向的感染猴G0402V13d樣品和G0404V7d樣品中分別獲得病毒env區(qū)2.2kb的目的片段,替換掉SHIV-KB9的相應(yīng)部分后得到了四種不同序列的pSHIV-TC全長克隆。將這些克隆轉(zhuǎn)染293T細胞后收集到的病毒上清感染TZM-bl細胞,評價病毒的體外感染能力。其中來源于G0402V動物的克隆株SH

7、IV-TC21的感染活性最強,SHIV-TC22沒有活性；來源于G0404V動物的兩個克隆株SHIV-TC41和SHIV-TC42的感染活性較弱。
　　 選擇細胞水平活性最高的感染性克隆SHIV-TC21進行猴體水平的活性分析。動物G0405V盛染后出現(xiàn)一過性的病毒載量和細胞免疫反應(yīng)。傳代后,病毒的毒力增強,感染猴G0406V的病癥較為顯著,表現(xiàn)為:急性期較高的病毒復(fù)制水平,潛伏期維持較久的可檢出的病毒載量；由CD8+T細胞顯著

8、增多引起的外劇血CD4+/CD8+值明顯倒置,且長期維持在0.2附近:并伴隨慢性腹瀉的臨床癥狀。比較SHIV-XJ02170與其感染性克隆SHIV-TC21的猴體實驗結(jié)果,證明SHIV-TC21的毒力明顯強于親本株SHIV-XJ02170。
　　 綜上,通過對SHIV-XJ02170在一系列中國恒河猴體內(nèi)的傳代特點和病毒env基因序列的分析,初步探討了病毒毒力增強的分子機制:由此構(gòu)建出4個env基因序列不同的SHIV-TC感染性