MiR-9通過抑制糖異生水平與青蒿琥酯通過SIRT1保護(hù)胰島細(xì)胞免受細(xì)胞因子損傷緩解糖尿病的分子機制研究.pdf

1、糖尿病根據(jù)其發(fā)生機制以及臨床表現(xiàn)不同可分為1型和2型，1型主要發(fā)病年齡在30歲以下，以青少年居多，發(fā)病急，常出現(xiàn)酮癥酸中毒。1型糖尿病又稱為胰島素依賴型糖尿病，是指需要長期不間斷補充外源性胰島素而維持機體代謝需要。此型糖尿病多數(shù)由于機體本身胰島細(xì)胞因炎癥、病毒、高血糖或者自身免疫等導(dǎo)致胰島細(xì)胞死亡、胰島細(xì)胞數(shù)目減少，胰島素分泌絕對不足引起。所以此型糖尿病若能保護(hù)胰島細(xì)胞的受損，則可緩解糖尿病癥狀。2型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，其

2、發(fā)病年齡多在40歲以后，尤以中老年人居多，發(fā)病慢。此型病人血漿胰島素水平可正常甚至高于正常，多出現(xiàn)胰島素抵抗，外周組織對葡萄糖利用率減低，引起高血糖。機體血糖的平衡得益于維持血糖的產(chǎn)生和利用間處于動態(tài)平衡狀態(tài)。肝臟是糖代謝的重要器官，尤其在饑餓條件下，肝糖異生成為血糖的主要來源，但是糖異生的過度激活是構(gòu)成引起血糖異常升高的主要因素之一。而胰腺β細(xì)胞分泌胰島素促進(jìn)機體正常生理情況下外周組織對糖的利用，在維持血糖平衡中占據(jù)著重要的地位。因此

3、無論這兩個方面中的任何一個方面出現(xiàn)功能障礙均可導(dǎo)致糖代謝紊亂，或是糖的產(chǎn)生增多，或是糖的利用減少，引起血糖升高，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。肝臟糖異生是在饑餓條件下被強烈激活，增加肝糖輸出(HGP)以滿足機體對葡萄糖需求的肝臟糖代謝過程。在糖尿病小鼠模型中糖異生水平也異?；钴S。而大量研究表明叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)在饑餓小鼠模型以及糖尿病小鼠模型中高表達(dá)。而在糖皮質(zhì)激素地塞米松以及腺苷酸環(huán)化酶激活劑毛喉素(Forskolin)誘導(dǎo)下的正常小鼠

4、肝細(xì)胞系TAMH中FoxO1也高表達(dá)，同時激活一系列包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)等糖異生關(guān)鍵酶的高表達(dá)，引起糖異生水平增高，導(dǎo)致HGP增加。研究表明腫瘤及糖代謝紊亂可導(dǎo)致包括miR-9、miR-29等多種微小RNA(miRNA)表達(dá)譜的改變，從而通過它們對靶基因的調(diào)控，加劇代謝紊亂及腫瘤發(fā)生。大量研究表明叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)家族是miRNA調(diào)控的靶點。同時在子宮內(nèi)膜癌中，高表達(dá)的miR

5、-9抑制了腫瘤抑制因子FoxO1的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)一系列病生理的改變，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外研究發(fā)現(xiàn)miR-29在糖尿病小鼠中高表達(dá)，而它卻能在饑餓情況下抑制糖異生關(guān)鍵酶G6Pase以及轉(zhuǎn)錄共激活子PGC-1α的表達(dá)，從而下調(diào)空腹血糖水平。那么在代謝紊亂的機體中異常表達(dá)的miR-9是否與高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子FoxO1之間存在一定的調(diào)控關(guān)系，其機制不清楚。
　　本研究應(yīng)用禁食小鼠模型、肥胖小鼠模型、糖尿病小鼠模型以及正常小鼠肝臟細(xì)胞系T

6、AMH細(xì)胞進(jìn)行研究，分別檢測了小鼠肝臟組織以及TAMH細(xì)胞中相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平以及相關(guān)RNA、miR-9的表達(dá)水平，并對轉(zhuǎn)錄因子FoxO1及其下游基因PEPCK、G6Pase的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)禁食正常小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄因子FoxO1及其下游基因PEPCK、G6Pase的表達(dá)水平是明顯升高的，這與之前大量相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。而miR-9的表達(dá)相對于正常喂食小鼠明顯降低，而肥胖小鼠與糖尿病小鼠的miR-9表達(dá)也明顯降低。而用腺病毒過表

7、達(dá)miR-9的肥胖小鼠能緩解肥胖小鼠的糖耐量受損并增強胰島素敏感性;同時我們在TAMH細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9 mimic后，發(fā)現(xiàn)FoxO1的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor卻得到相反的結(jié)果;用計算機軟件預(yù)測miR-9在FoxO13'非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)域結(jié)合位點序列，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明miR-9在FoxO13'UTR區(qū)域有結(jié)合并能對FoxO1發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。因此研究結(jié)果證明miR-9靶向抑制性調(diào)

8、控FoxO1的表達(dá)，從而下調(diào)糖異生關(guān)鍵基因PEPCK、G6Pase，進(jìn)而抑制肝糖異生水平，降低HGP。同時我們在TAMH細(xì)胞中過表達(dá)miR-9后，在Forskolin誘導(dǎo)下模擬饑餓狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白表達(dá)與對照組相比明顯下調(diào)，同時糖異生關(guān)鍵酶PEPCK、G6Pase的表達(dá)水平也明顯下降，且細(xì)胞上清中糖輸出水平也有明顯下降。胰島素通過一系列信號通路促進(jìn)外周組織對葡萄糖的利用，是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素;同時胰島素是合成代謝激素，可促進(jìn)

9、糖原、脂肪、蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)葡萄糖向其他能源或結(jié)構(gòu)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)糖的代謝去路。胰島素由胰腺β細(xì)胞分泌，其分泌調(diào)節(jié)受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等調(diào)節(jié)。而胰腺β細(xì)胞的損傷和凋亡被認(rèn)為是引起胰島素分泌絕對量不足的主要原因，其損傷因子為多方面，如病毒、自身免疫、高糖、棕櫚酸以及致炎因子等。在這些調(diào)節(jié)介質(zhì)中，白介素(IL)-1β對β細(xì)胞的損傷受到越來越大的關(guān)注。青蒿琥酯（Artesunate ART）是從傳統(tǒng)中

10、藥中分離出的青蒿素衍生物，具有抗病毒、抗炎以及抗癌作用，多年來被認(rèn)為是治療瘧疾最有效和安全的試劑，但是到目前為止關(guān)于它在糖尿病中的作用很少有報道。
　　本文探究了青蒿琥酯是否可以保護(hù)胰腺β細(xì)胞免受細(xì)胞因子IL-1β誘導(dǎo)的損傷。用Griess Assay盒檢測一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。Western blot檢測SIRT1以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性，RNA干擾法沉默Sirt1

11、的表達(dá)。葡萄糖刺激胰島素分泌實驗(GSIS)用于檢測ART對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用。MTT實驗和Hochest/PI雙染實驗分別用于檢測ART對胰島細(xì)胞的活力和凋亡作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART逆轉(zhuǎn)了因IL-1β誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞損傷，且ART抑制了IL-1β誘導(dǎo)的核因子(NF)-kB信號通路的激活以及iNOS的表達(dá)與NO的產(chǎn)生;同時發(fā)現(xiàn)ART逆轉(zhuǎn)了INS-1細(xì)胞以及胰島中IL-1β誘導(dǎo)的SIRT1蛋白表達(dá)的下降，我們也進(jìn)一步用干擾小RNA(siR