自噬調節(jié)全反式維甲酸誘導髓系白血病細胞分化的機制研究.pdf

1、急性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一類特殊的急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)。PML-RARα融合蛋白導致APL的發(fā)生。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)可以通過PML-RARα融合蛋白降解促進細胞分化成熟使APL達到臨床緩解。自噬能促進PML-RARα融合蛋白的降解，但目前尚不清楚自噬參與PML-R

2、ARα融合蛋白的降解的具體機制和作用。
　　 首先，本研究以NB4細胞和HL-60細胞為研究對象，運用免疫熒光法，Western blotting、流式細胞儀及透射電鏡分析等實驗方法，觀察ATRA誘導髓系白血病細胞發(fā)生自噬的情況。研究結果顯示治療劑量下ATRA誘導髓細胞發(fā)生自噬；相反，添加自噬抑制劑(3-MA)后能抑制自噬的發(fā)生。進一步利用白血病細胞系，分析了自噬相關基因在ATRA誘導髓系白血病細胞自噬中的作用。研究發(fā)現(xiàn)采用RN

3、A干擾技術降低自噬相關基因在細胞中的表達后，抑制了ATRA誘導細胞產生的自噬，并且導致細胞凋亡增加。
　　 其次，為了進一步探討自噬在ATRA誘導髓系白血病細胞分化中的作用，本研究采用流式細胞學和細胞形態(tài)學，發(fā)現(xiàn)在ATRA干預細胞時，同時加自噬抑制劑(3-MA)后能抑制ATRA誘導細胞分化成熟；相反，同時加自噬誘導劑(雷帕霉素)能促進ATRA誘導細胞分化成熟。再用RNA干擾技術，抑制自噬相關基因的表達，在誘導分化劑作用下能有效抑

4、制髓系白血病細胞分化。以上結果證明了自噬調節(jié)ATRA誘導的細胞分化。
　　 最后，本研究發(fā)現(xiàn)自噬在髓系白血病細胞中調節(jié)ATRA誘導的PML-RARα融合蛋白降解；p62與PML-RARα融合蛋白結合調節(jié)PML-RARα融合蛋白降解和髓系白血病細胞分化。本研究先利用蛋白酶、caspases或自噬等抑制劑分別阻斷蛋白降解途徑，通過Westernblotting分析發(fā)現(xiàn)ATRA可誘導PML-RARα融合蛋白降解。再采用RNA干擾、免疫

5、熒光等技術，使自噬相關蛋白Atg5表達抑制，減少了PML-RARα融合蛋白降解和抑制自噬發(fā)生。然后利用免疫共沉淀技術，發(fā)現(xiàn)p62/SQSTM1與PML-RARα融合蛋白結合，免疫熒光技術顯示兩者在細胞中共定位。RNA干擾后p62表達抑制，抑制了細胞的分化和PML-RARα融合蛋白降解；相反，采用基因轉染技術，使p62過表達，增加PML-RARα融合蛋白傳送到溶酶體。研究顯示出細胞中適當p62水平維持PML-RARα融合蛋白在一定水平，從

6、而調節(jié)髓系白血病細胞分化成熟，這一過程是通過蛋白酶體和自噬溶酶體兩條通路共同完成的。
　　 綜上所述，ATRA抑制mTOR通路并激活了Atg1-PI3KC3-Atg5自噬通路，此通路促進自噬體發(fā)生；確認了p62與PML-RARα融合蛋白在細胞內相互作用調節(jié)PML-RARα融合蛋白降解。低表達的p62抑制了PML-RARα融合蛋白的降解；相反，抑制自噬發(fā)生導致p62在胞內聚集，通過一個負反饋機制抑制蛋白酶體活性和PML-RARα融