氨肽酶N-CD13抑制劑烏苯美司增強全反式維甲酸誘導急性早幼粒白血病細胞分化作用及機制的研究.pdf

1、急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓細胞白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)的一個特殊亞型，具有獨特的臨床、細胞遺傳學和分子生物學表現(xiàn)。由于臨床嚴重的出血傾向，早期死亡率很高。自1988年我國學者首先應(yīng)用全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)對APL進行誘導分化治療，APL的臨床轉(zhuǎn)歸發(fā)生了巨大的改變，對ATRA的高度敏感

2、性使APL成為臨床可治愈的AML亞型。然而單用ATRA治療維持緩解的時間短，容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者常對ATRA耐藥，以及ATRA應(yīng)用過程中的副反應(yīng)等，仍是APL治療中面臨的嚴重障礙。而且，ATRA對APL之外其它類型的AML療效差。因此，尋找能夠增強ATRA誘導分化作用的藥物，以及探索藥物增強ATRA誘導分化作用的分子機制一直是白血病分化治療研究中的熱點。 氨肽酶N/CD13(aminopeptidaseN/CD13，APN/CD1

3、3)是一種鋅離子依賴的金屬蛋白酶，在多種腫瘤包括AML細胞中均呈高表達。最近研究表明，APN/CD13不僅通過蛋白水解酶的活性發(fā)揮作用，還參與細胞內(nèi)信號傳導、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲等多種病理生理過程。Ubenimex為細胞表面APN/CD13和亮氨酸氨基肽酶的抑制劑，不僅通過增強宿主免疫功能、誘導腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用，ubenimex還具有刺激骨髓祖細胞生成和分化的作用。我們設(shè)想：Ubenimex對原代APL細胞以及其他髓系白血病細

4、胞是否具有同樣的效應(yīng)?Ubenimex能否恢復(fù)對ATRA耐藥的APL細胞株對ATRA的敏感性?Ubenimex作為細胞表面APN/CD13的靶向藥物，其與ATRA的作用途徑中是否存在共同的作用點?APN/CD13在其中又具有怎樣的作用?本研究共分二部分。一、APN/CD13抑制劑ubenimex對ATRA誘導分化作用的影響；二、APN/CD13抑制劑ubenimex增強ATRA誘導NB4細胞分化作用機制的研究。 在第一部分的研究

5、中，首先通過流式細胞儀檢測細胞表面CD13陽性表達率，以及RT-PCR法檢測PML-RARαmRNA的表達，分別了解ubenimex和ATRA的作用靶點在所采用的細胞株中的表達情況，并對細胞株進行初步的鑒定。NB4細胞、MR2細胞、HL-60細胞均高表達髓系分化抗原CD13，其陽性表達率分別為99.8％、99.5％、99.7％，同時作為陰性對照的K562細胞的CD13陽性表達率為3.36％；NB4細胞、MR2細胞具有PML-RARαmR

6、NA的表達，HL-60細胞和K562細胞不具有PML-RARαmRNA的表達。單用100μg/mlubenimex不能誘導NB4細胞、原代APL細胞、MR2細胞、HL-60細胞和K562細胞的分化。在NB4細胞中，10nmol/LATRA單獨作用72h，NB4細胞出現(xiàn)部分分化的形態(tài)，與100μg/mlubenimex聯(lián)合處理72h，NB4細胞分化的形態(tài)表現(xiàn)更加明顯。10nmol/LATRA單獨處理72h，NB4細胞CD11b表達明顯增高

7、；100μg/mlubenimex與10mol/LATRA聯(lián)合處理72h，NB4細胞CD11b表達的增加更加明顯，與10nmol/LATRA組相比，差異有統(tǒng)計學意義(60.6±9.2vs.32.0±5.5，p＜0.01)。藥物作用72h，一定濃度ubenimex(50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)呈濃度依賴性增強10nmol/LATRA誘導NB4細胞的NBT還原能力，與單用ATRA組相比，差異有統(tǒng)計學意義(17.6±2.

8、5vs.12.0±2.2，p＞0.05；23.5±3.2vs.12.0±2.2,p＜0.05；36.0±8.3vs.12.0±2.2，p＜0.01)；100μg/mlubenimex能夠增強不同濃度(10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L)ATRA誘導NB4細胞的NBT還原能力，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異有統(tǒng)計學意義(32.3±9.4vs.12.4±2.5；40.7±5.3vs.15.7±2.6；50.8±5.5v

9、s.21.8±2.4；p＜0.01)。藥物作用48h-96h，100μg/mlubenimex呈時間依賴性增強10nmol/LATRA誘導NB4細胞的NBT還原能力，與相應(yīng)時間點單用ATRA組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(23.0±5.0vs.8.9±1.8；32.0±7.1vs.14.4±0.8；61.4±4.0vs.17.2±1.2；p＜0.01)。表明ubenimex呈劑量和時間依賴性增強ATRA對NB4細胞的誘導分化作用。

10、第二部分的研究表明ubenimex能夠增強ATRA誘導NB4細胞和初發(fā)APL細胞分化的作用。在第二部分的研究中，對ubenimex增強ATRA誘導分化作用的可能機制進行了初步的探索。p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinase，p38MAPK)的活化在ATRA誘導NB4細胞分化過程中發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用。為了解p-p38MAPK在ubenimex增強ATRA誘導分化過程中的作用，通過Wester

11、nblot檢測ubenimex與ATRA處理后，p-p38MAPK表達的改變。藥物作用24h-96h，100μg/mlubenimex呈時間依賴性抑制NB4細胞p38MAPK的磷酸化水平。10nmol/LATRA單獨作用72h，引起NB4細胞p38MAPK的磷酸化，100μg/mlubenimex能夠抑制10nmol/LATRA引起的NB4細胞p38MAPK的磷酸化。表明ubenimex可能通過抑制ATRA引起的p38MAPK磷酸化，減

12、弱其負調(diào)節(jié)作用，從而增強ATRA的誘導分化作用。在MR2細胞中，盡管100μg/mlubenimex也呈時間依賴性抑制MR2細胞p38MAPK的磷酸化水平，但100nmol/LATRA作用72h，不引起MR2細胞p38MAPK的磷酸化。提示ubenimex不能恢復(fù)MR2細胞對ATRA誘導分化作用的敏感性，可能與MR2細胞不具有ubenimex發(fā)揮增強效應(yīng)的靶點有關(guān)，這也為ubenimex通過抑制p38MAPK的磷酸化來增強ATRA誘導N

13、B4細胞分化的作用提供了反證。5μg/ml抗APN/CD13抗體WM-15單獨引起NB4細胞p38MAPK的磷酸化；其與100μg/mlubenimex聯(lián)用，部分阻斷100μg/mlubenimex抑制NB4細胞p38MAPK磷酸化的作用。5μg/mlWM-15單獨處理不能誘導NB4細胞的NBT還原能力，5μg/mlWM-15對10nmol/LATRA誘導NB4細胞NBT的還原能力也沒有明顯影響，但5μg/mlWM-15預(yù)先處理能夠阻斷

14、100μg/mlubenimex增強10nmol/LATRA誘導NB4細胞NBT的還原能力(12.8±5.2vs.40.3±6.3，p＜0.01)。表明ubenimex可能通過細胞表面APN/CD13的介導，抑制NB4細胞p38MAPK的磷酸化，達到增強ATRA誘導分化的作用。原癌基因c-myc表達的下調(diào)與ATRA誘導多種髓系白血病細胞的分化過程均有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用4h，100μg/mlubenimex協(xié)同10nmol/LATR

15、A下調(diào)c-mycmRNA的表達，與單用10nmol/LATRA組相比，差異有統(tǒng)計學意義(0.36±0.11vs.0.68±0.05，p＜0.05)。藥物作用8h，一定濃度ubenimex呈劑量依賴性增強10nmol/LATRA下調(diào)c-Myc蛋白的表達；且不同濃度ubenimex與10nmol/LATRA聯(lián)合應(yīng)用各組c-Myc蛋白的表達水平與NBT還原能力之間呈明顯負相關(guān)(r=-0.940，p=0.017)。表明ubenimex協(xié)同ATR

16、A下調(diào)c-myc的表達可能與其增強ATRA誘導分化的作用有關(guān)。10nmol/LATRA單獨或與100μg/mlubenimex聯(lián)合處理12h，NB4細胞CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancerbindingprotein，C/EBPε)mRNA的表達水平均明顯提高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；但該兩組間無明顯差異。提示ubenimex可能不通過對C/EBPεmRNA表達的調(diào)節(jié)增強ATRA的誘導分化作用

17、。 綜上所述，本研究得出結(jié)論如下：1、Ubenimex呈劑量和濃度依賴性增強ATRA誘導NB4細胞分化的作用，并能增強ATRA誘導初發(fā)APL原代細胞分化的作用；2、Ubenimex單獨應(yīng)用可以抑制NB4細胞和MR2細胞p38MAPK的磷酸化水平；3、Ubenimex可以抑制ATRA所引起的NB4細胞p38MAPK的磷酸化；4、抗CD13抗體部分阻斷ubenimex抑制NB4細胞p38MAPK磷酸化的作用；5、抗CD13抗體阻斷u