急性早幼粒白血病細胞中全反式維甲酸對UBA3表達的調(diào)控作用與機制.pdf

1、背景：急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是一種較為罕見的疾病，是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的一種特殊類型。它是目前人們認識最清楚的惡性腫瘤之一，同時也是唯一一個能夠通過靶向療法治愈的惡性腫瘤。20世紀70年代，蒽環(huán)類藥物的療法讓一些APL病人得到治愈，但易導致DNA損傷。直到1985年全反式維甲酸（all-trans retinoic ac

2、id，ATRA）的引入提升了這些病人的治療反應，并使這種疾病的預后獲得了革命性的進步。臨床試驗中，結(jié)合ATRA的現(xiàn)代治療方法使得超過90％的病人脫離治療并無病生存五年以上。ATRA在體內(nèi)和體外均可誘導APL細胞迅速分化為粒細胞，并且臨床上ATRA只需三到五周就能使APL病人緩解。ATRA發(fā)揮治療作用的機制一直是研究的熱點，至今尚未完全闡明。NEDD8（neural precursor cell expressed development

3、ally downregulated protein8）是近年來研究比較熱的多種類泛素蛋白中的一種，是一個僅包含81個氨基酸的小分子蛋白質(zhì)，其與相應底物共價結(jié)合的過程稱為 Neddylation。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1（ amyloid-βprecursor protein binding protein1，APPBP1）與類泛素修飾活化酶3（ubiquitin-like modifier activating enzyme3，

4、UBA3）結(jié)合而成的異二聚體構(gòu)成Neddylation的活化酶E1，而UBA3在其中作為催化亞基，對Neddylation修飾的正常進行至關(guān)重要。經(jīng)典的NEDD8底物是cullins，主要參與細胞周期和凋亡的調(diào)控；介導cullins發(fā)生Neddylation的E3連接酶是Rbx1（RING box protein1），生成的Neddylated cullins（約90-100kDa）增強相應酶復合體的活性。已有研究證明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展很

5、可能與Neddylation修飾系統(tǒng)的異常有關(guān)。NEDD8活化酶E1的特異性抑制因子MLN4924已經(jīng)在多種實體瘤和白血病中顯示具有很好的治療效果，進入臨床II期研究。因此，靶向Neddylation修飾系統(tǒng)有望為未來癌癥治療帶來新的曙光。已有研究表明，Neddylation促進AML細胞的生存和增殖，但是還不清楚Neddylation對APL細胞的分化有無影響，及在ATRA的治療效應中具有怎樣的作用。為解答上述科學問題，我們開展了本課

6、題研究。
　　目的：在APL細胞中探索Neddylation參與ATRA治療作用的機制；探討ATRA對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用及分子機制；探索UBA3在APL細胞惡性生長中的作用及分子機制；探索APL治療的新靶點。
　　方法：為了研究ATRA對UBA3表達的調(diào)節(jié)作用，以ATRA處理APL細胞系HL60及NB4細胞，通過Western Blot（WB）檢測Neddylation相關(guān)蛋白水平指標Neddylated cullins

7、、UBA3及APPBP1的表達，通過實時熒光定量PCR（QPCR）檢測UBA3的mRNA表達水平。為了研究ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達的分子機制，用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑E64d/pepstatinA處理NB4及HL60細胞，WB檢測UBA3及Neddylated cullins的水平；用ATRA處理HL60及NB4細胞后，WB檢測自噬指標LC3BII的表達情況；用自噬誘導劑rapamycin處理HL60及NB4細胞后，WB

8、檢測LC3BII、UBA3及Neddylated cullins的表達情況。為研究Neddylation系統(tǒng)在APL細胞惡性生長中的作用及其可能機制，通過NEDD8活化酶E1抑制劑MLN4924處理或者以短發(fā)夾RNA（short hairpinRNA， shRNA）敲低 UBA3抑制 Neddylation，進行細胞生長曲線分析和軟瓊脂集落形成實驗分析檢測對惡性生長的影響；凋亡檢測和細胞周期分析探討影響惡性生長的機制；流式細胞儀檢測表面

9、Marker CD11b和吉姆薩染色揭示對APL細胞未分化狀態(tài)的影響。為分析經(jīng)典底物在其中的作用，我們用攜帶Rbx1 shRNA的慢病毒感染HL60細胞，引起內(nèi)源性Rbx1的表達沉默進而導致cullins Neddylation的減弱，并通過上述方法觀察其對HL60細胞生長曲線、凋亡、細胞周期進程、形態(tài)及CD11b表達的影響。
　　結(jié)果：⑴WB檢測ATRA處理APL細胞株HL60及NB4細胞0d、1d、2d、3d、4d、5d后的U

10、BA3的表達結(jié)果顯示：隨著作用時間的延長，UBA3的表達量逐漸降低，表明ATRA能夠抑制APL細胞中UBA3的表達，并且呈時間依賴性。QPCR檢測ATRA處理HL60細胞0d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達結(jié)果顯示：隨著時間的延長，UBA3的mRNA水平卻呈上升趨勢，因此在ATRA處理APL細胞時，UBA3的蛋白水平與其mRNA水平的變化是相反的，提示UBA3表達量的下降可能是蛋白穩(wěn)定性下降。⑵蛋白酶體抑制劑MG132處理HL

11、60細胞不能逆轉(zhuǎn)ATRA誘導的UBA3表達量下降，提示UBA3的下降不是通過蛋白酶體介導的。溶酶體抑制劑E64d/pepstatinA在HL60細胞里比較好的逆轉(zhuǎn)ATRA誘導的UBA3蛋白量下降，而且在NB4細胞中也有部分的逆轉(zhuǎn)，提示ATRA是通過溶酶體途徑誘導UBA3蛋白量下降的。ATRA處理HL60及NB4細胞后，自噬指標LC3BII上升，證實了ATRA能夠誘導自噬；而自噬誘導劑rapamycin處理HL60及NB4細胞后，UBA3

12、及Neddylated cullins指標均下降，提示ATRA通過誘導自噬增強溶酶體活性進而減弱UBA3蛋白的表達量。⑶通過MLN4924處理或者敲低UBA3抑制Neddylation，進行如下分析：生長曲線分析表明，MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著抑制HL60及NB4細胞的生長；軟瓊脂集落形成實驗分析表明MLN4924能夠顯著抑制HL60及NB4細胞的集落形成能力。?凋亡檢測和細胞周期分析表明MLN4924處理或者敲低UB

13、A3均能夠顯著促進HL60及NB4細胞的凋亡、誘導細胞周期進程阻滯。吉姆薩染色結(jié)果表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠使HL60及NB4細胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多；表面Marker CD11b檢測結(jié)果分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠誘導 HL60及NB4細胞CD11b表達增加。因此，UBA3及其介導的Neddylation促進APL細胞生長、存活及細胞周期進程，并維持其未分化狀態(tài)。⑷敲低Rbx1后

14、，生長曲線分析表明HL60細胞的生長受到顯著抑制；凋亡檢測表明HL60細胞的凋亡增加；細胞周期進程分析表明HL60細胞周期進程阻滯在G0/G1期；吉姆薩染色結(jié)果表明HL60細胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多；CD11b表面Marker檢測結(jié)果分析表明HL60細胞CD11b表達顯著增加。因此，敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制整體Neddylation類似的效應，提示Neddylation通過經(jīng)典底

15、物cullins促進APL細胞的惡性生長。
　　結(jié)論：ATRA通過誘導自噬抑制UBA3的表達，進而抑制Neddylation。UBA3及其介導的Neddylation促進 APL細胞生長、存活及細胞周期進程，并維持其未分化狀態(tài)。對Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應的重要機制。敲低Rbx1以減弱cullinsNeddylation具有和抑制UBA3類似的效應，提示Neddylation通過經(jīng)典底物cullin