全反式維甲酸耐藥性急性早幼粒白血病細(xì)胞靶向多肽的篩選及鑒定.pdf

1、全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合以蒽環(huán)類藥物為主的化療是臨床上急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)誘導(dǎo)緩解的首選療法，能夠使患者的初治完全緩解率達(dá)80％-95％。然而ATRA耐藥性的產(chǎn)生常常導(dǎo)致APL化療失敗，嚴(yán)重影響了ATRA的治療效果。而現(xiàn)有的對ATRA耐藥細(xì)胞治療策略均不完善。因此，尋求ATRA耐藥細(xì)胞的有效治療措施是目前APL研究的一大方向。本論文構(gòu)建APL細(xì)胞的ATRA耐藥細(xì)胞株，并以其作為靶細(xì)胞，采用新型基于微流控的噬菌體篩選技術(shù)，以

2、期獲得能夠與ATRA耐藥性APL細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列，獲得的主要試驗結(jié)果如下:
　　1、APL細(xì)胞ATRA耐藥株的構(gòu)建及鑒定
　　采用濃度遞增間歇誘導(dǎo)法，以ATRA對兩株APL細(xì)胞HL-60、NB4進行體外誘導(dǎo)篩選，成功獲得了具有穩(wěn)定耐藥性狀的細(xì)胞株HL-60R、NB4R。同時發(fā)現(xiàn)，與親代細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株的一些生物學(xué)特性發(fā)生了明顯變化:①體積有所增大，且大小不一;②生長增殖速度減慢、群體倍增時間延長;③對其它多種化療

3、藥物產(chǎn)生了一定程度的耐藥性，即具有一定的多藥耐藥性狀。
　　2、ATRA耐藥性APL細(xì)胞特異性結(jié)合多肽的篩選及鑒定
　　以構(gòu)建的ATRA耐藥性APL細(xì)胞作為正篩細(xì)胞、親代APL細(xì)胞作為負(fù)篩細(xì)胞，采用基于微流控的噬菌體篩選方法進行了全細(xì)胞消減篩選，成功獲得了四個一致性較高的噬菌體單克隆，所展示的外源十二肽序列分別為:27號(SPTSSFQVGTFA)、26號（TLTTHGRLFESN）、5R5號（WAITKPAPAAHP）、5

4、R13號(TSTTFKSHLDHH)。
　　一方面，同源比對結(jié)果顯示，27號、5R5號、5R13號序列分別與層粘連蛋白(LN)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、鈣粘蛋白(cadherin)具有較高的同源性，而NCAM、cadherin為同類親和性蛋白，據(jù)此推測用作篩選的ATRA耐藥性APL細(xì)胞表面可能高表達(dá)這三種蛋白相應(yīng)的受體分子，即層粘連蛋白受體(LR)、NCAM、cadherin;文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，LR、NCAM、cadherin在

5、多種耐藥腫瘤細(xì)胞表面顯著上調(diào)表達(dá)，并與細(xì)胞對化療藥物的耐受性相關(guān);同時PCR初步鑒定結(jié)果顯示，NCAM-mRNA在HL-60R細(xì)胞中明顯表達(dá)，而在HL-60細(xì)胞幾乎不表達(dá)，這與生物信息學(xué)預(yù)測推斷的結(jié)果相一致。
　　另一方面，噬菌體單克隆與靶細(xì)胞的結(jié)合特異性試驗（滴度測定法、免疫熒光法、流式細(xì)胞實驗）結(jié)果均證實，27號、26號、5R5號、5R13號噬菌體單克隆能夠與ATRA耐藥性APL細(xì)胞HL-60R、NB4R特異性結(jié)合;其中5R5

6、號、27號噬菌體展示多肽能夠與另一急性淋巴細(xì)胞白血病多藥耐藥株CEM/C1結(jié)合，表明這兩個噬菌體展示多肽可能是耐藥細(xì)胞的廣譜結(jié)合肽。
　　綜上所述，我們首先采用濃度遞增間歇誘導(dǎo)法，成功構(gòu)建了兩株APL細(xì)胞HL-60、NB4相應(yīng)的耐藥細(xì)胞株HL-60R、NB4R。并且以該ATRA耐藥性APL細(xì)胞作為正篩細(xì)胞、親代APL細(xì)胞作為負(fù)篩細(xì)胞，進行了基于微流控的全細(xì)胞消減篩選，成功獲得了四個高度富集的噬菌體單克隆;且體外多個實驗證實，這四個