蟾蜍靈誘導急性早幼粒細胞白血病細胞凋亡及增強維甲酸誘導分化作用機制研究.pdf

1、目的:蟾酥具有強心、麻醉、解毒、醒神等藥理作用，已被廣泛用于腫瘤等多種疾病的治療。蟾蜍靈(bufalin)是中藥蟾酥中分離提取的蟾蜍毒素配基之一。國外及我們的研究表明，蟾蜍靈具有抑制內(nèi)皮細胞增殖及血管生成，選擇性抑制白血病細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞生長，誘導細胞分化及凋亡的作用。 國外研究表明蟾蜍靈可誘導K562、U937等白血病細胞分化。蟾蜍靈可直接抑制細胞膜Na+/K+-ATP酶，但蟾蜍靈誘導K562細胞分化的能力強于苦毒毛旋花

2、子苷，而后者是Na+/K+-ATP酶的特異性抑制劑，提示蟾蜍靈誘導白血病細胞分化作用不僅是抑制Na+/K+-ATP，可能還有其他機制。PKC特異性抑制劑明顯降低蟾蜍靈誘導的成熟單核細胞標志IL2-β基因表達，提示cPKC參與蟾蜍靈誘導的細胞分化。有學者報道蟾蜍靈可以恢復維甲酸耐藥的急性早幼粒細胞白血病(AcutePromyelocyticLeukemia，APL)原代培養(yǎng)細胞對維甲酸的敏感性。目前有關蟾蜍靈對全反式維甲酸(ATRA)誘導

3、APL細胞分化的影響及相關的機制未見報道。 研究表明蟾蜍靈可抑制前列腺癌細胞增殖并誘導凋亡，其機制可能與蟾蜍靈活化Caspase-3，8，9有關。有學者報道高濃度蟾蜍靈可誘導HL-60和U937細胞凋亡，bcl-2及c-myc基因表達降低。我們以前的研究表明，蟾蜍靈誘導HL-60細胞凋亡時上調(diào)Smac/DIABLO蛋白表達，降低Bcl-2/Bax比值。 腫瘤細胞凋亡凋亡途徑由半胱天冬酶(Caspase)家族蛋白酶介導和執(zhí)

4、行。Caspase家族在細胞凋亡的分子機制中作為重要的效應子執(zhí)行凋亡。凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAPs)通過與Caspase相互作用來抑制細胞凋亡，生存素(Survivin)是IAPs家族成員之一，在多種腫瘤細胞以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤均高表達。Survivin通過直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性發(fā)揮抗凋亡作用。我們最近的研究表明蟾蜍靈誘導HL-60凋亡下調(diào)Survivin基

5、因表達，活化Caspase-3。目前蟾蜍靈誘導APL細胞凋亡過程中的Survivin及Caspase-3的作用目前尚未見報道。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-ActivatedProteinKinases，MAPK)信號轉導系統(tǒng)是細胞外信號引起核反應的細胞信息傳遞的共同通路，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellularsignal-regulatedkinases，ERK)、C-JUN氨基末端激酶(c-junN-te

6、rminalkinases，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-ActivatedProteinKinases，p38)三個主要成員。多種細胞外刺激均可將信號傳至細胞內(nèi)，引起MAPK系統(tǒng)激酶連鎖磷酸化。ERK1和ERK2是ERK中的兩個重要成員，磷酸化的ERK(P-ERK)是其活化形式，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡等生理過程。國外研究表明，在一些腫瘤細胞中，ERK抑制劑PD98059通過抑制ERK活性進而抑制腫瘤

7、生長，抑制ERK的活力可以放大紫杉醇、順鉑等化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡作用。我們以前的研究提示ERK信號途徑負向調(diào)節(jié)蟾蜍靈誘導K562細胞凋亡，目前有關蟾蜍靈誘導APL細胞凋亡過程中信號轉導機制的研究并無報道。 APL占急性髓系白血病的8％～10％，早幼粒細胞白血病/維甲酸受體(PromyelocyticLeukemia-RetinoicAcidReceptoralphaPML-RARα)基因及其編碼的融合蛋白是發(fā)病的主要分子機制

8、。我國學者首次用ATRA治療APL取得巨大成功，從此腫瘤誘導分化療法便成為癌腫研究的一個熱點。ATRA誘導APL細胞分化可以恢復PML正常定位、促進PML-RARα融合蛋白降解。臨床研究指出，APL用ATRA與化療合理組合治療，完全緩解(CompleteRemission，CR)率明顯提高，但緩解期短，部分患者對ATRA不敏感，易產(chǎn)生耐藥和復發(fā)，還有部分患者易并發(fā)高白細胞癥和維甲酸綜合征(RetinoicAcidSyndrome，RAS

9、)，這迫使人們對ATRA的耐藥、復發(fā)以及副作用進行深入研究，并尋求一種新的聯(lián)合治療方案來減少復發(fā)及副作用的產(chǎn)生。國外研究表明蟾蜍靈可以逆轉APL細胞對ATRA的耐藥，恢復對ATRA的敏感性，但機制不明。 為進一步明確蟾蜍靈誘導白血病細胞凋亡及促分化的確切機理，本實驗擬采用蟾蜍靈作用于人類急性早幼粒細胞白血病NB4細胞及原代培養(yǎng)細胞，觀察蟾蜍靈對APL細胞增殖抑制、誘導凋亡作用，進一步研究蟾蜍靈在誘導凋亡過程中對Survivin基

10、因表達及Caspase-3的影響，闡述MAPK信號轉導通路在蟾蜍靈誘導細胞凋亡過程中的作用，深入探討蟾蜍靈對ATRA誘導APL細胞分化作用的影響及可能機制。 方法1.細胞增殖測定：采用臺盼藍拒染法，繪制增殖曲線。 2.細胞凋亡的檢測：Wright-Giemsa染色形態(tài)學分析，流式細胞儀進行DNA含量檢測細胞凋亡。 3.細胞誘導分化的檢測：通過形態(tài)學分析、NBT還原試驗、細胞表面標記抗原CD11b采用流式細胞儀解析

11、。 4.SurvivinmRNA及PML/RARαmRNA表達采用RT-PCR檢測。 5.Survivin、Caspase-3蛋白及p-ERK1/2蛋白采用WesternBlot檢測。 6.統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)用3次獨立實驗的平均值表示，結果進行t檢驗、方差分析，用SPSS11.5forWindows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。 結論:1.蟾蜍靈以時間、劑量依賴的方式抑制NB4細胞增殖，高濃度時誘導NB4細胞凋亡

12、，下調(diào)SurvivinmRNA及蛋白表達，并活化Caspases-3，提示蟾蜍靈誘導的NB4細胞凋亡可能與下調(diào)Survivin基因表達及活化Caspase-3有關。 2.抑制ERK信號轉導通路增強蟾蜍靈誘導NB4細胞凋亡作用，并進一步下調(diào)Survivin表達、活化Caspase-3，提示ERK途徑可能參與了蟾蜍靈誘導NB4細胞凋亡，抑制該途徑，可起到增強蟾蜍靈誘導凋亡作用。 3.蟾蜍靈低濃度時增強ATRA對NB4及APL