Egfl7的新作用：通過EGFR活化FAK促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是當(dāng)前嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的重大惡性腫瘤，而其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡率居高不下的最主要原因。究其發(fā)生的機(jī)制雖有大量研究，但目前仍未完全闡明。因此，深入研究HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并以此為基礎(chǔ)探索防治復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效措施，對進(jìn)一步提高HCC的總體治療水平具有重要意義。 表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(Egfl7)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，已有的研究證明其在胚胎血管發(fā)育的成管過程中發(fā)揮了重要作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)Egfl

2、7能夠顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力，提示Egfl7具有調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移的生物學(xué)功能。更重要的是，Egfl7在胚胎組織中高水平表達(dá)，在成熟組織中幾乎不表達(dá)，而在腫瘤等增殖性組織中呈高度上調(diào)，提示Egfl7可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，Egfl7 mRNA在HCC組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)并與HCC包膜形成密切相關(guān)，提示Egfl7可能參與HCC侵襲轉(zhuǎn)移過程，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究在進(jìn)

3、一步分析Egfl7在HCC中表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，通過慢病毒介導(dǎo)的小RNA干擾技術(shù)抑制Egfl7的表達(dá)，通過一系列體外、體內(nèi)方法研究Egfl7調(diào)控HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，同時(shí)探討阻斷Egfl7表達(dá)對 HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響。我們獲得了以下研究結(jié)果： 1.我們采用半定量RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Westem blot等方法檢測了Egfl7 mRNA和蛋白在31例新鮮HCC組織及相應(yīng)鄰近非瘤肝組織(ANLT)中的表達(dá)水

4、平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Egfl7 mRNA和蛋白在HCC組織中均明顯高表達(dá)，且Egfl7在孤立性大肝癌(SLHCC)中的表達(dá)明顯低于結(jié)節(jié)性肝癌(NHCC)。免疫組化法檢測112例HCC組織的結(jié)果顯示Egfl7在90.2％(101/112)的HCC組織中表達(dá)，且其表達(dá)水平與HCC的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、有無靜脈浸潤及有無包膜形成等臨床病理特征密切相關(guān)。Egfl7高表達(dá)組HCC患者的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間均明顯短于Egfl7低表達(dá)組的患者，且單因素與多因

5、素Cox回歸模型均顯示Egfl7高表達(dá)是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)，夾心ELISA法發(fā)現(xiàn)HCC病人血清中Egfl7水平相對于慢性肝病病人、胃腸道惡性腫瘤病人、肝良性腫瘤病人和正常人亦明顯上升(詳見顏鵬等其他研究生畢業(yè)論文)。這些結(jié)果提示Egfl7的高表達(dá)與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能因此而影響了HCC患者的預(yù)后。 2.雙標(biāo)間接組織免疫熒光法檢測Egfl7在HCC組織中的分布情況，結(jié)果顯示Egfl7絕大多數(shù)定位于HCC組織

6、中的腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。Western blot方法檢測Egfl7蛋白在HepG2、MHCC97-L及HCCLM3這三種侵襲轉(zhuǎn)移能力依次升高的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)并以常氏肝細(xì)胞系CCL13作為對照，結(jié)果顯示Egfl7蛋白在三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較之CCL13細(xì)胞系均明顯升高，且以HCCLM3細(xì)胞系的表達(dá)水平最高，在MHCC97-L細(xì)胞系中的表達(dá)水平次之，HepG2最低，提示Egfl7的表達(dá)水平與與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

7、3.我們構(gòu)建了pLKO.1Egfl7RNAi+ siRNA質(zhì)粒，并建立了穩(wěn)定表達(dá)Egfl7 siRNA片斷和對照片斷的HCCLM3細(xì)胞(HCCLM3Egn7RNAj+和HCCLM3Egn7RNAi-)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCCLM3 Egfl7RNAi+細(xì)胞中Egfl7蛋白的表達(dá)被明顯抑制，干預(yù)效率超過70％。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞較HCCLM3 Egn7RN

8、Ai-細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯下降；MTT法結(jié)果顯示HCCLM3Egfl7RNAi+和HCCLM3Egn7RNAi-細(xì)胞的增殖能力無顯著性差異(P>0.05)；Annexin V和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示HCCLM3Egfl7RNAi+與HCCLM3Egfl7RNAi-細(xì)胞的凋亡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。且Bcl-xL和BAX在HCCLM3Egfl7RNAi+與HCCLM3Egfl7RNAi-細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異性(

9、P>0.05)。這些研究結(jié)果均提示：體外抑制Egfl7的表達(dá)可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)，而不影響其增殖和凋亡。 4.已有研究發(fā)現(xiàn)Egfl7敲除的小鼠中，血管內(nèi)皮細(xì)胞中局部粘著斑激酶(FAK)的磷酸化水平明顯下降，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力明顯減弱。我們因而推測，Egfl7可能通過促進(jìn)FAK磷酸化激活從而調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。因此，我們用Western blot法證明HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞中總FAK水平?jīng)]有

10、明顯改變，但磷酸化FAK水平明顯下降。當(dāng)我們用全長重組Egfl7蛋白(50ng/ml)刺激HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞后，Western blot檢測結(jié)果顯示其磷酸化FAK水平明顯上調(diào)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示其肌動(dòng)蛋白(F-actin)細(xì)胞骨架發(fā)生明顯的形變；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)證明其遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果提示Egfl7可通過調(diào)控FAK磷酸化激活從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。 5.鑒于Egfl7擁

11、有兩個(gè)表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-likedomain)，我們推測其可能通過表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)FAK的磷酸化激活。因此，我們利用EGFR的特異性抑制劑(15μM)先行處理HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞，再施以Egfl7蛋白(50ng/ml)刺激，觀察HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞中FAK磷酸化水平、細(xì)胞骨架及遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化。結(jié)果顯示，HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞中FAK磷酸化水平無明顯變化，F(xiàn)-a

12、ctin細(xì)胞骨架無明顯形變，細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力亦無明顯增強(qiáng)，即EGFR抑制劑可阻斷Egfl7蛋白刺激HCCLM3Egfl7RNAi+細(xì)胞所產(chǎn)生的后續(xù)效應(yīng)，提示Egfl7通過EGFR介導(dǎo)FAK磷酸化而促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)，證明Egfl7/ EGFR/FAK這一信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。 6.為在體內(nèi)觀察抑制Egfl7對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，我們在HCCLM3轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞裸鼠模型的基礎(chǔ)上，建立了裸鼠原位肝

13、癌轉(zhuǎn)移模型。免疫組化結(jié)果顯示，siRNA抑制Egfl7表達(dá)后，裸鼠肝臟原位HCCLM3種植瘤中Egfl7及磷酸化FAK的表達(dá)水平明顯下調(diào)；測量肝臟原位種植瘤的大小及周圍結(jié)節(jié)數(shù)目，結(jié)果顯示體內(nèi)抑制Egfl7的表達(dá)能夠抑制HCCLM3原發(fā)瘤的生長并減少其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移；裸鼠肺組織連續(xù)切片計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目，結(jié)果顯示體內(nèi)抑制Egfl7能夠抑制HCCLM3細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果證明體內(nèi)抑制Egfl7表達(dá)可抑制FAK磷酸化并顯著抑制了HCC的生長和肝內(nèi)

14、外轉(zhuǎn)移。 我們的上述研究結(jié)果首次證明Egfl7在HCC組織及病人血清中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與HCC腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、包膜形成及靜脈浸潤等臨床病理特征密切相關(guān)，并顯著影響了HCC患者的預(yù)后。同時(shí)，我們首次發(fā)現(xiàn)Egfl7主要表達(dá)于HCC組織中的腫瘤細(xì)胞，且Egfl7可通過EGFR介導(dǎo)FAK磷酸化促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)，從而在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制Egfl7表達(dá)可在體內(nèi)外顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究首次揭示了Egfl7在H