高低不同轉移特性MCF7細胞亞株的篩選及基因表達的差異分析.pdf

1、目的:篩選高低不同轉移特性并穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的人乳腺癌MCF7細胞亞株，檢測細胞亞株之間基因表達的差異，以篩選乳腺癌骨轉移相關基因。 方法:利用脂質體轉染GFP入人乳腺癌MCF7細胞，通過有限稀釋法、細胞電泳，獲得高低不同轉移特性的細胞亞株，測定細胞亞株的增殖率，通過組織形態(tài)學觀察、軟瓊脂克隆形成率、transwell小室體外侵襲能力測定、裸鼠體內成瘤試驗等研究細胞亞株的生物學特性；將C6作為實驗組，A2為對照組，用cDNA

2、微陣列的方法比較兩個細胞亞株之間基因表達的差異；用實時定量PCR法檢測、驗證cDNA微陣列中顯著差異表達的整合素aV基因和微陣列中宋涉及的整合素a4基因。 結果:獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白不同轉移特性的兩個細胞亞株A2(高轉移特性)和C6(低轉移特性)，其中A2的群體倍增時間為25.6h，軟瓊脂形成率為30.7％；C6群體倍增時間為41.8h，軟瓊脂形成率為14％；transwell小室體外侵襲能力測定發(fā)現(xiàn)，A2細胞亞株的平均侵襲

3、細胞數(shù)為136.80±12.36個，明顯高于C6的平均侵襲細胞數(shù)73.62±9.76個；裸小鼠皮下成瘤試驗發(fā)現(xiàn)A2成瘤時間短，瘤體直徑大，細胞增殖快。A2、C6細胞亞株的基因芯片結果發(fā)現(xiàn)，2個細胞亞株之間發(fā)生顯著性表達變化的基因有767個，其中與A2相比，在C6中上調表達的基因有480個，下調表達的基因有287個。在發(fā)生明顯表達變化的基因中具有比較明顯的功能類別特征的包括與細胞骨架結構相關的基因、與細胞生長及增殖調控相關的基因、以及與細

4、胞氧化張力應激反應相關的基因，提示與A2細胞相比，C6細胞表現(xiàn)出細胞增殖抑制，細胞結構變化以及應激反應活化等特征。實時定量PCR檢測A2、C6細胞亞株的ITGA-V基因發(fā)現(xiàn)，A2細胞亞株樣本的ITGA-V基因平均拷貝數(shù)為6574.56，C6細胞亞株ITGA-V基因的平均拷貝數(shù)為318.84，A2細胞亞株ITGA-V基因的拷貝數(shù)大于C6細胞亞株的ITGA-V基因的拷貝數(shù)；實時定量PCR檢測A2、C6細胞亞株的ITGA4基因發(fā)現(xiàn)，A2細胞亞

5、株樣本的ITGA4基因平均拷貝數(shù)為19.98，C6細胞亞株的平均拷貝數(shù)為49.26，A2細胞亞株ITGA4基因的拷貝數(shù)小于C6細胞亞株ITGA-V基因的拷貝數(shù)。 結論:篩選出的兩個細胞亞株有不同的轉移特性，GFP的整合及表達未對MCF7細胞的生長狀態(tài)、生物學性狀未造成明顯影響，可作為報告基因進一步研究乳腺癌骨轉移的機制和治療；cDNA微陣列法對于篩選乳腺癌骨轉移相關基因有獨特的優(yōu)勢，獲得的差異表達基因具有較強的代表性，為尋找乳腺