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1、目的本課題通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液實(shí)現(xiàn)體外分離人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞并利用輔以細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V體外培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞。并以HBV病毒蛋白組分HBsAg誘導(dǎo)刺激樹(shù)突狀細(xì)胞,使其產(chǎn)生針對(duì)HBV特異性的細(xì)胞免疫作用。通過(guò)ELISA、MTT、免疫組化等方法檢測(cè)DC的免疫功能狀態(tài)。并采用穩(wěn)定分泌HBV病毒抗原的2.2.15細(xì)胞株與DC混合培養(yǎng)來(lái)觀察經(jīng)重組HBsAg誘導(dǎo)的DC對(duì)2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝抑制作用,從而探討HBsAg作為免疫誘導(dǎo)劑改
2、善DC功能,治療HBV慢性感染的作用,尋求慢性HBV感染治療的新思路。方法收集慢性乙型肝炎患者30例及正常對(duì)照20例之外周血,淋巴細(xì)胞分離液分離病人和正常對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞。并分為重組HBsAg處理組(A組)、乙肝組(B組)、正常對(duì)照組(C組)三組。以無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V(添加細(xì)胞因子IFN-ot、GM-CSF、IL-4)體外培養(yǎng)并分離出DC。通過(guò)光鏡、瑞氏染色、電鏡鑒定DC形態(tài),流式細(xì)胞檢測(cè)DC表面CD80/CD86表達(dá)、免疫組
3、化檢測(cè)DC表面HLA-DR的表達(dá)、ELISA檢測(cè)DC分泌IL.12情況、混合淋巴細(xì)胞試驗(yàn)(MLR)檢測(cè)DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖作用。在A組DC培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度重組HBsAg(O、5、10、25、40[tg/m1)刺激誘導(dǎo)(分別為Al、A2、A3、A4組),并通過(guò)MLR檢測(cè)DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖作用,以ELISA檢測(cè)DC分泌細(xì)胞因子IL—12的變化情況。將不同濃度誘導(dǎo)后的DC與2.2.15細(xì)胞混合培養(yǎng),分別收集24h、48
4、h、72h培養(yǎng)的上清,ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)情況。 結(jié)果1、光鏡、瑞氏染色、電鏡、CD80/CD86表達(dá)情況、HLA-DR表達(dá)情況及培養(yǎng)上清中IL一12水平從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面分子的表達(dá)和功能三方面檢測(cè)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功體外分離培養(yǎng)出較高純度人外周血DC。2、B組IL.12分泌水平及MLR同種異體淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)刺激指數(shù)明顯低于C組(P<0.05)。A3、A4組IL-12分泌水平及MLR同種異體淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)刺
5、激指數(shù)明顯高于B組(P<0.05),A4組與C組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。IL.12分泌水平及對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)刺激指數(shù)均存在明顯劑量一效果依賴關(guān)系(相關(guān)指數(shù)O<r<1)。3、B組與2.2.15混合培養(yǎng)上清HBeAg抑制率明顯低于C組及A4組(P<0.05),A組HBeAg抑制率隨重組HBsAg處理濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。各組對(duì)HBsAg分泌的抑制率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論慢性乙肝患者外周血DC存在功能障礙
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