溶血磷脂抗缺血誘導的間充質(zhì)干細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、干細胞移植治療缺血性心肌病無論是動物實驗還是臨床實驗均獲得了較大的進展。然而，細胞移植后數(shù)小時內(nèi)大量的供體細胞死亡嚴重制約了細胞治療的療效。心肌缺血微環(huán)境誘導的凋亡性死亡被認為是導致供體細胞大量丟失的一個主要因素。迄今為止，許多策略已經(jīng)被探索用于提高移植細胞的存活，然而，這些策略或因其自身不足不能很好的提高供體細胞存活或因使受體產(chǎn)生一定的毒副作用而限制了其臨床上的使用。 溶血磷脂(Lysophospholipids，LPs)是簡

2、單的磷脂類，最初作為細胞膜生物合成中的組分而被識別。研究表明，溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)和1—磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-Phosphate，SIP)作為溶血磷脂家族中兩個主要成員分別通過各自特異的G蛋白偶聯(lián)受體參與調(diào)節(jié)多種重要的生理以及病理生理學過程。本文前期的研究表明，LPA能夠拮抗缺氧無血清誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)凋亡，而LP

3、A是否體內(nèi)也有保護作用以及S1P作為LPA的同一個家族成員是否也能抗缺血誘導的MSC凋亡均不清楚。 MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的進化上保守的非編碼的小RNA，其以一種翻譯抑制或mRNA降解的方式轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。miRNA在生物體發(fā)育、細胞的增殖與凋亡、細胞分化、腫瘤形成等一系列的生命活動中均扮演著不可替代的角色。究竟miRNA在缺血誘導的MSCs凋亡的過程中扮演了怎樣的角色，其通過何種機制參與MSCs的凋亡均

4、未可知。 本論文首先致力于LPA對移植的MSCs的保護作用體內(nèi)實驗的探討；同時對另一種更有臨床應用前景的脂質(zhì)分子S1P對MSC的抗凋亡作用進行體內(nèi)體外實驗的詳細研究。另外，對miRNA在缺血誘導的MSCs凋亡中的作用進行了初步研究。這些研究將有助于產(chǎn)生促進供體細胞存活的治療新策略。 本研究包括以下3部分內(nèi)容： 1、雌性SD大鼠左冠狀動脈前降支結扎建立心梗模型，然后被隨機分成3組，包括單純DMEM注射組(Group

5、l)，雄性MSCs注射組(Group2)和LPA預處理的雄性MSCs注射組(Group3)，細胞注射量為2×106。通過Realtime-PCR技術檢測SRY基因和TUNEL的方法評價移植細胞存活，結果表明LPA預處理提高了移植MSCs存活；而且免疫組化染色血小板內(nèi)皮細胞粘附分子—1表明移植LPA預處理的MSCs促進了毛細血管的發(fā)生，同樣體外實驗也表明LPA促進了缺氧無血清條件下MSCs的VEGF分泌。超聲心動圖評價心功能揭示了LPA預

6、處理的MSCs移植沒有獲得心功能的改善。以上數(shù)據(jù)表明，LPA預處理能夠提高移植MSCs存活，增強其旁分泌作用，促進血管的發(fā)生，是一種有效地提高移植的MSC存活的策略。 2、通過建立的缺氧無血清誘導的大鼠MSCs凋亡模型來評價S1P的抗凋亡作用。結果顯示，S1P通過Gi蛋白偶聯(lián)SIP1受體以及下游的Akt和ERK1/2信號通路濃度依賴性的拮抗了缺氧無血清誘導的MSC凋亡。體內(nèi)實驗方法同LPA一致，結果表明：在細胞移植1小時、1天和

7、1周后，S1P處理組存活的MSCs明顯多于無S1P處理組存活的MSCs；移植S1P處理的MSCs在1周后促進了心肌梗死區(qū)和周邊區(qū)血管的發(fā)生。另外，S1P促進了缺氧無血清條件下VEGF的分泌，證明了其旁分泌作用的存在。以上數(shù)據(jù)表明，S1P處理MSCs是一種新的改善MSCs存活和促進血管發(fā)生的治療策略。 3、對0小時、1.5小時、6小時缺氧無血清處理的MSC做miRNA芯片分析，結果表明，隨著時間進程，miR—503等4個miRNA

8、表達逐漸升高；而miR—185等3個miRNA表達先升高再降低；miR—195等4個miRNA先降低再升高；miR—483等2個miRNA逐漸降低。Real-TimePCR的方法驗證上述芯片結果表明miR—503等4個miRNA表達升高，其中miR—337是芯片結果沒有發(fā)現(xiàn)而本研究驗證時發(fā)現(xiàn)了其表達的異常升高；miR—122a等3個miRNA表達降低。統(tǒng)計學表明，miR—503和miR—337的上調(diào)以及miR—483的下調(diào)均具顯著性差異