Smad3 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選鑒定及該基因與糖基轉(zhuǎn)移酶之間相關(guān)性的初步研究.pdf

1、目的：Smad3是肝纖維化進(jìn)程中的TGF—β/Smads途徑的一個(gè)重要蛋白，Smad3是介導(dǎo)TGF—β信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞、活化肝星狀細(xì)胞的直接承擔(dān)者，在肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本文以Smad3基因?yàn)檠芯繉ο?，?gòu)建篩選出該基因的有效siRNA干擾載體，并初步探討糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc—T家族與Smad3基因之間的相互關(guān)系。 方法：遵循RNA干擾目標(biāo)序列的選取原則，利用互聯(lián)網(wǎng)資源對Smad3基因mRNA序列設(shè)計(jì)三條可能的小

2、干擾RNA（siRNA），分別將這三段siRNA插入到RNA干擾真核表達(dá)載體pRNAT—U6．1/Neo中構(gòu)建成三條干擾載體；脂質(zhì)體介導(dǎo)三條載體轉(zhuǎn)染至肝星狀細(xì)胞，采用RT—PCR的方法篩選出其中一條對Smad3抑制作用最佳的載體，RT—PCR和Western—Blot進(jìn)一步鑒定該載體對Smad3的抑制作用；接下來利用已構(gòu)建篩選出的pRNAT—SiSmad3轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞，建立Smad3的下調(diào)表達(dá)模型，檢測糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc—T家

3、族的表達(dá)情況，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的干擾表達(dá)載體pSilenCircle—SiT2轉(zhuǎn)染入肝星狀細(xì)胞，建立下調(diào)表達(dá)ppGalNAc—T2的細(xì)胞模型，再檢測Smad3基因的表達(dá)。進(jìn)而初步探討Smad3與糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc—Ts基因家族的關(guān)系。 結(jié)果：成功構(gòu)建三條Smad3的siRNA表達(dá)載體，并篩選出其中一條對Smad3基因抑制效率較高的siRNA表達(dá)載體。檢測出轉(zhuǎn)染了該有效siRNA表達(dá)載體的肝星狀細(xì)胞中Smad3的m

4、RNA和蛋白表達(dá)都受到了有效抑制，而糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc—Ts的mRNA表達(dá)也隨之發(fā)生了一些變化。同時(shí)，在ppGalNAc—T2下調(diào)表達(dá)的細(xì)胞中，Smad3在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)幾乎沒有變化。 結(jié)論：成功篩選到一個(gè)Smad3基因的siRNA干擾載體，繼而可轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞，并抑制其中Smad3蛋白的表達(dá)，為研究SiRNA方法在肝纖維化中的治療作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。另外，下調(diào)表達(dá)Smad3后，ppGalNAc—T