PCV2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10信號(hào)途徑的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病(PCVD)正嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)，其主要病原是豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。PCV2引起仔豬免疫抑制是眾多細(xì)胞因子分泌紊亂的結(jié)果。豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)是重要的免疫細(xì)胞，也是PCV2的主要靶細(xì)胞。了解PCV2引起PAMs分泌細(xì)胞因子的變化及其調(diào)控途徑可為闡明PCV2致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)選取了20頭PCV2和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原抗體均為陰性的30日齡斷奶仔豬，無菌分離肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)

2、，分為四組進(jìn)行W體外培養(yǎng):對(duì)照組，MyD88干擾組（干擾組），PCV2感染組（PCV2組），MyD88干擾-PCV2感染組（干擾-PCV2組）。用小干擾RNA(siRNA)方法干擾MyD88基因的表達(dá)，并分別于PCV2作用后0h、6h、12h、24 h和48 h收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。熒光定量PCR法檢測干擾效率;ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的動(dòng)態(tài)變化;間接免疫熒光(IFA)的方法檢測NF-κB/P65蛋

3、白核易位的情況;western blot方法檢測胞核中NF-κB蛋白以及細(xì)胞漿內(nèi)MyD88、p-IκB和NF-κB/P65蛋白的表達(dá);EMSA方法檢測胞核中NF-κB與DNA結(jié)合活性。結(jié)果顯示，對(duì)體外培養(yǎng)PAMs分泌IL-1β、IL-6的能力，在PCV2作用后6h和12 h均有明顯的促進(jìn)作用，12 h后雖然IL-1β的分泌量仍明顯高于對(duì)照組，但已呈下降趨勢，而12h后IL-6的分泌已恢復(fù)到對(duì)照組水平。在體外培養(yǎng)12h前，PCV2對(duì)PAM

4、s分泌IL-10基本無影響，12h后逐漸升高，且顯著高于對(duì)照組。說明PCV2能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10。間接免疫熒光和western blot結(jié)果可見PCV2感染6h后，PAMs胞核中NF-κB/P65蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）;EMSA結(jié)果表明，PCV2組與對(duì)照組相比NF-κB與DNA結(jié)合活性，PCV2感染后12 h均極顯著升高;PCV2感染PAMs后6h，胞漿中p-IκB

5、蛋白的表達(dá)量就顯著升高（P＜0.05），12h后差異顯著性水平均為P＜0.01，而對(duì)照組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異。PAMs中MyD88表達(dá)量，PCV2組從6h開始均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果表明，PCV2能通過IκB的磷酸化降解上調(diào)PAMs中MyD88-NF-κB信號(hào)蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴隨IL-1β、IL-6和IL-10分泌增多。
　　siRNA的結(jié)果，siRNA能使PAMs中78％的MyD88基因沉默，并顯著影響其

6、蛋白表達(dá)。MyD88基因沉默后的PAMs再用PCV2作用（干擾-PCV2組），IL-1β、IL-6和IL-10的分泌量均顯著低于同時(shí)間PCV2組（P＜0.05或P＜0.01）。PAMs胞核中NF-κB/P65蛋白表達(dá)量，干擾-PCV2組雖然也有所升高，但12h后均顯著低于PCV2組（P＜0.05或P＜0.01）;干擾-PCV2組PAMs胞核中NF-κB與DNA結(jié)合活性，在24 h和48 h顯著低于PCV2組（P＜0.01）;PAMs胞漿

7、中IκB的磷酸化水平（p-Iκ蛋白表達(dá)量），12h后干擾-PCV2組均顯著低于PCV2組（P＜0.01）;干擾-PCV2組PAMs中MyD88表達(dá)量較低，且在12h、24 h、48 h顯著低于PCV2組（P＜0.01）。結(jié)果說明，一旦將PAMs中MyD88基因沉默后，PCV2通過上調(diào)IκB的磷酸化降解激活NF-κB信號(hào)途徑的作用就下降，與此同時(shí)PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10量就隨之降低。
　　綜上所述，PCV2可通過