內(nèi)分泌干擾物雙酚A的長期暴露致小鼠肝臟脂質(zhì)堆積的機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 長期雙酚A暴露小鼠模型的建立及其脂代謝狀況檢測
　　目的:研究人類日常暴露劑量雙酚A的長期慢性暴露對小鼠脂代謝的影響。
　　材料和方法:建立雙酚A暴露的小鼠模型。母鼠自生產(chǎn)第一天起，給予含有2.5μg/L（約0.5μg/kg/d，為人類日常接觸劑量）雙酚A的水。對照組母鼠則喂養(yǎng)單純含溶劑（0.1％體積乙醇）的水。小鼠3周斷奶后，繼續(xù)給雄性子代小鼠喂養(yǎng)和其母親含有相同劑量雙酚

2、A的水。檢測對照組及雙酚A組的雄性子代小鼠8周及10個月的體重、肝臟重量及內(nèi)臟脂肪重量。用血糖測試儀測試其空腹血糖;用ELISA試劑盒測試其血清胰島素水平;用TBA120FR生化分析儀檢測小鼠血清血脂及肝轉(zhuǎn)氨酶水平;用甘油三酯及膽固醇試劑盒測試小鼠肝臟甘油三酯及膽固醇水平;用油紅-O染色及H&E染色觀察小鼠肝臟脂肪堆積情況。
　　結(jié)論:長期慢性接觸人類日常暴露劑量的雙酚A會使小鼠在10月齡（中年）發(fā)生體重增加、血糖血脂異常、肝臟甘

3、油三酯及膽固醇堆積等代謝改變。
　　第二部分 長期雙酚A暴露小鼠的肝臟脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況
　　目的:研究長期雙酚A暴露小鼠的肝臟脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化情況以探究雙酚A暴露導(dǎo)致小鼠脂代謝異常的機(jī)制。
　　材料和方法:取雙酚A及對照組兩組8周及10月大雄性小鼠的肝臟組織，用Trizol法提取總RNA，運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用SYGR-Green法運用7900Real-Time PCR儀器行實時定量PCR檢測比

4、較兩組小鼠肝臟的脂代謝相關(guān)酶及脂代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:十月齡的小鼠中，雙酚A暴露組肝臟組織中脂肪酸及膽固醇合成相關(guān)的基因表達(dá)明顯上升，且甘油三酯及膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)明顯下降。其中Fasn的表達(dá)量雙酚A組是對照組的2倍，而Scd1、Hmgcr及Sqle的表達(dá)量則是對照組的4倍。另外，調(diào)控脂肪酸及膽固醇合成關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子Srebf1及Srebf2的表達(dá)也明顯上升。
　　結(jié)論:雙酚A所致

5、的肝臟脂肪代謝異常及相關(guān)血脂異常的可能機(jī)制有:肝臟脂肪酸及膽固醇合成增加、肝臟甘油三酯及膽固醇轉(zhuǎn)運異常及脂肪酸氧化分解抑制。而其中肝臟脂肪酸及膽固醇的合成增加在BPA所致脂代謝異常中可能發(fā)揮主要作用。轉(zhuǎn)錄因子Srebf1及Srebf2的表達(dá)上升則在BPA所致肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)異常中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　第三部分 DNA甲基化異常致雙酚A暴露小鼠脂代謝相關(guān)基因差異表達(dá)
　　目的:探究DNA甲基化在雙酚A所致小鼠脂代謝基

6、因表達(dá)異常中發(fā)揮的作用。
　　材料和方法:取雙酚A及對照組兩組8周及10月大雄性小鼠的肝臟組織，提取DNA、總RNA及蛋白質(zhì)。利用MassARRAY TM EpiTYPER DNA甲基化定量分析技術(shù)分析肝臟脂代謝相關(guān)的幾個關(guān)鍵基因某個或某些特定CpG位點的甲基化水平。用Real-time PCR及western blot檢測比較兩組小鼠肝臟的甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1、Dnmt3a及Dnmt3b)的表達(dá)情況。運用Dnmt1/3a/3

7、b siRNA將Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞系Dnmt1/3a/3b敲除后檢測Hepa1-6細(xì)胞系中的脂代謝相關(guān)基因的DNA甲基化水平、mRNA表達(dá)水平及Hepa1-6細(xì)胞系中甘油三酯及膽固醇的水平，以探究DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對脂代謝相關(guān)基因DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用。運用BPA處理Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞系并觀察DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況，以探究BPA暴露對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:8周小鼠中，雙酚A暴露組的S

8、rebf2及Hmgcr啟動子區(qū)域的整體DNA甲基化水平較對照組低。10月小鼠中，雙酚A暴露組Srebf1，Srebf2，F(xiàn)asn及Hmgcr轉(zhuǎn)錄起始位點整體DNA甲基化水平都較對照組低。另外上述兩個年齡組的雙酚A組小鼠四個脂肪合成相關(guān)基因的多個CpG位點DNA甲基化水平也較對照組低。實時定量PCR和western blot檢測顯示，雙酚A暴露組的8周小鼠中Dnmt1及Dnmt3a的mRNA、蛋白表達(dá)量和10月小鼠的Dnmt3b的mRNA

9、、蛋白表達(dá)量較對照組低。Hepa1-6細(xì)胞系中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶敲除可導(dǎo)致脂代謝合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄起始位點的去甲基化及mRNA表達(dá)量上升。BPA處理Hepa1-6可以下調(diào)Hepa1-6 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:雙酚A暴露組中Srebf1，Srebf2，F(xiàn)asn及Hmgcr啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平下降可能在雙酚A所致上述四個基因表達(dá)上升中發(fā)揮一定作用。而雙酚A暴露組中甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的下降是這些基因啟動子區(qū)域DN