耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌的分子特征、耐藥機(jī)制及藥物發(fā)現(xiàn).pdf

1、抗生素濫用和不合理使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性已成為世界抗感染治療領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題之一。2014年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）首次在全球范圍內(nèi)收集病原菌耐藥(antibacterial resistance，ABR)情況數(shù)據(jù)，發(fā)布全球性耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告及指導(dǎo)原則[1]，其中革蘭氏陰性腸桿菌科細(xì)菌耐藥問(wèn)題尤為嚴(yán)重。中國(guó)作為抗生素使用大國(guó)，細(xì)菌耐藥情況更是不容樂(lè)觀(guān)。有報(bào)道稱(chēng)我國(guó)住院患者使用廣譜抗生素或聯(lián)合使用兩

2、種以上抗生素比例約為58％，大大超過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[2]。世界衛(wèi)生組織2012年在中國(guó)收集的約5.5萬(wàn)株臨床肺炎克雷伯桿菌中，耐碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥菌比例為7.1％，對(duì)第三代頭孢菌素類(lèi)藥物頭孢噻肟耐藥率則高達(dá)52.5％[3]。中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告也顯示，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素雖高度敏感，但總耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，從2006年＜1％上升到2013年≤7％。
　　革蘭氏陰性耐藥菌包括產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌（大腸埃希菌

3、、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等）和非發(fā)酵糖細(xì)菌(non-fermenters)（鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等）。其中，肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌耐藥情況最為嚴(yán)重，伴隨著越來(lái)越多臨床多重耐藥和泛耐藥菌株的出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床抗感染治療日益困難。
　　導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，按照Amber分類(lèi)分為三類(lèi):A類(lèi)，B類(lèi)和D類(lèi)。

4、其中，B類(lèi)碳青霉烯酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-beta-lactamase，MBL)，包括NDM-1、VIM2、IMP等。此類(lèi)酶可水解頭孢菌素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)抗生素，但對(duì)單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（氨曲南）和EDTA等螯合劑敏感，主要存在于銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌和腸桿菌科細(xì)菌。
　　產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的超級(jí)肺炎克雷伯桿菌于2009年首次在印度新德里被發(fā)現(xiàn)[4]，除了可以水解幾乎所有臨床常用藥，blaNDM-1常與其他

5、耐藥基因，比如ESBLs，共存共轉(zhuǎn)移擴(kuò)大耐藥菌底物譜而引起廣泛關(guān)注。其中blaCTX-M-15在共轉(zhuǎn)移ESBLs耐藥基因中最為常見(jiàn)，同時(shí)blaCTX-M-15也是九十多種CTX-M亞型中世界范圍內(nèi)檢出率最高的一種。其次，blaTEM-1，blaOXA-1，blaOXA-10也常常被同時(shí)檢出[5]。CTX-M-15可高度水解頭孢噻肟，適度水解氨曲南，填補(bǔ)了NDM-1不能水解氨曲南的空白，兩者共存，擴(kuò)大了攜帶NDM-1耐藥菌的耐藥范圍，增加

6、了感染NDM-1病人的用藥困難。
　　不僅如此，與NDM-1耐藥酶基因相關(guān)的可移動(dòng)遺傳元件，如轉(zhuǎn)座子，整合子，毒力因子，可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒等，以及其他種類(lèi)耐藥酶基因的存在，使得攜帶NDM-1的耐藥菌不僅對(duì)三代頭孢菌素類(lèi)藥物耐藥，對(duì)其他大多數(shù)抗生素如喹諾酮類(lèi)，氨基糖苷類(lèi)藥物也耐藥，并且呈現(xiàn)傳播越來(lái)越廣泛的特點(diǎn)。目前已經(jīng)在肺炎克雷伯菌[6]，大腸埃希菌[7]以及枸櫞酸桿菌[8]中發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaCTX-M-15的可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒

7、。最近幾年，在國(guó)內(nèi)也有關(guān)于NDM-1在不動(dòng)桿菌屬[9-11]，屎腸球菌[12]，肺炎克雷伯菌[13]以及大腸埃希菌[14]中被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。由此可見(jiàn)，攜帶NDM-1以及同時(shí)攜帶NDM-1和CTX-M-15的革蘭氏陰性耐藥菌所造成的感染將成為革蘭氏陰性菌感染中最棘手的問(wèn)題之一，并且大有傳播日益廣泛的威脅。
　　抗生素的濫用和不合理使用問(wèn)題可依靠制定抗生素使用規(guī)范，加強(qiáng)抗菌藥物使用管理予以控制，而細(xì)菌耐藥性問(wèn)題則需從多方面入手解決，一方

8、面加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)臨床合理用藥（對(duì)指導(dǎo)臨床合理選藥，提高療效，控制多藥耐藥菌的流行有重要意義）;一方面，從基因水平對(duì)耐藥菌傳播機(jī)制進(jìn)行研究，研發(fā)細(xì)菌耐藥抑制劑（如水解酶抑制劑、外排泵抑制劑等）;另一方面尋求新型抗菌藥物，如非抗生素的天然抗菌肽、人工合成雜合抗菌肽及抗菌抗體等。
　　基于以上背景，以及本實(shí)驗(yàn)室保存有大量ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株和本地區(qū)醫(yī)院分離革蘭氏陰性菌等優(yōu)勢(shì)，本課題從三部分展開(kāi)研究:
　　第一部分，對(duì)北京

9、地區(qū)2002-2004年及2010-2014年收集的625株臨床腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行CRE耐藥率測(cè)定，結(jié)果顯示2002-2004年CRE耐藥率為0.8％，2010-2014年耐藥率增長(zhǎng)至4.9％。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的7株同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaCTX-M-15的特征腸桿菌科菌株進(jìn)行整合子、不相容質(zhì)粒群、流行性質(zhì)粒及菌株分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、耐藥機(jī)制分析等分子特征研究，為耐藥菌流行趨勢(shì)作出前瞻性研究，也為更進(jìn)一步揭示革蘭氏陰性耐藥菌耐藥

10、機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
　　第二部分，原核細(xì)胞重組表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床菌株中的碳青霉烯酶，建立重組碳青霉烯酶庫(kù)，用于篩選新型酶穩(wěn)定化合物或酶抑制劑，以及建立碳青霉烯酶質(zhì)譜庫(kù)，用于CRE菌株感染的早期診斷。表達(dá)的碳青霉烯酶分別為實(shí)驗(yàn)室保存標(biāo)準(zhǔn)菌株 K.pneumoniae ATCC(R)BAA2146， K.pneumoniae ATCC(R)700603， K.pneumoniaeATCC(R)BAA1898和 K.pneumonia

11、e ATCC(R)BAA1905中的碳青霉烯酶CTX-M-15，SHV-18，KPC1/2，KPC3以及臨床菌株P(guān).aeruginosa08-14和A.baumannii09-1中的碳青霉烯酶VIM2和OXA23。其中對(duì)CTX-M-15和VIM2進(jìn)行了重組酶水解活性測(cè)定和酶抑制劑水解保護(hù)特性研究，以及酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定。
　　第三部分，重組表達(dá)天然殺菌素ColicinⅠa，人工合成殺菌通透性增加蛋白(Batericidal per