大蒜素誘導(dǎo)人胃腫瘤細(xì)胞凋亡及凋亡途徑的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 胃腫瘤是我國常見的惡性腫瘤之一，總體五年生存率不到30％。目前的治療方法，包括根治性手術(shù)切除、化療、放療及其他綜合治療等，均未能有效提高腫瘤病人的治愈率和生存率，且大多數(shù)病人預(yù)后很差。胃癌經(jīng)常在晚期才被診斷，約有40％到50％患者診斷時(shí)已經(jīng)是局部晚期。大蒜素為百合科植物大蒜鱗莖中提取的特有的含硫化合物，化學(xué)名稱為二烯丙基三硫(Diallyl trisulfide，DATS)，傳統(tǒng)上大蒜素被用于抗細(xì)菌、病毒

2、和真菌的感染。近年來，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，DATS對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用，而且這種抑制作用對(duì)機(jī)體幾乎沒有毒副作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察DATS對(duì)分化程度不同的人胃腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及對(duì)凋亡過程中Caspase-3和Caspase-8的活性的影響，初步研究大蒜素誘導(dǎo)人胃腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑；通過建立人胃腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型，從整體水平上研究DATS對(duì)抗人胃腫瘤細(xì)胞BGC-823裸鼠移植瘤的作用機(jī)制。
　　 研究方法：<

3、br>　　 以MTT法檢測(cè)不同濃度的大蒜素對(duì)胃腫瘤細(xì)胞生長的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的作用性質(zhì)；采用細(xì)胞化學(xué)染色法和Hoechst33342染色法觀察DATS誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)，明確大蒜素誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞凋亡的最佳濃度和時(shí)間；以AnnexinV-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DATS誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞的凋亡率；使用Caspases活性檢測(cè)試劑盒，比色法測(cè)定Caspase-3和Caspase-8活性的變化，評(píng)價(jià)DATS對(duì)Caspases

4、酶活性的影響。
　　 培養(yǎng)人胃腺癌細(xì)胞BGC-823，細(xì)胞活力和數(shù)量符合接種要求時(shí)，接種至裸鼠右前肢腋部皮下，建立裸鼠人胃癌移植瘤模型；隨機(jī)分為模型組，DATS大、小劑量組(20、5mg/kg)；觀察裸鼠一般生存情況：監(jiān)測(cè)裸鼠體重的變化，同時(shí)觀察裸鼠攝食、攝水和精神狀態(tài)等變化；測(cè)量裸鼠移植瘤的短徑、長徑，計(jì)算瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線；處死裸鼠后，測(cè)量移植瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率；觀察瘤組織，取小塊組織常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色；

5、使用Caspases活性檢測(cè)試劑盒，比色法測(cè)定移植瘤組織中Caspase-3和Caspase-8活性的變化。
　　 結(jié)果：
　　 DATS對(duì)胃腫瘤細(xì)胞BGC-823、SGC-7901、MGC80-3、MKN-28增殖具有明顯的抑制作用，24d，時(shí)IC50分別為130．56μmol/L、143．45μmol/L、137．89μmol/L、168．49μmol/L；48小時(shí)IC50分別為96．25μmol/L、92．31μm

6、ol/L、100．63μmol/L、143．56μmol/L；72小時(shí)IC50分別為65．72μmol/L、83．16μmol/L、90．12μmol/L、156．23μmol/L。細(xì)胞化學(xué)染色觀察到DATS處理后的細(xì)胞體積皺縮、核濃縮、核邊集以及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)改變，對(duì)照組形態(tài)正常，核大小均一，貼壁良好。Hoechest33342熒光染色觀察可見核濃縮，致密的強(qiáng)熒光團(tuán)塊、凋亡小體等形態(tài)學(xué)變化，對(duì)照組則發(fā)微弱藍(lán)光。60μmol/

7、L的DATS作用24小時(shí)后，胃腫瘤細(xì)胞BGC-823、SGC-7901、MKN-28的凋亡率分別為21．57％±0．83％，12．31％±0．45％，10．97％±0．54％，均高于對(duì)照組3．48％±0．28％，6．75％±0．36％，4．59％±0．31％，P<0．05；比色法檢測(cè)Caspases酶活性提示，DATS能活化胃腫瘤細(xì)胞BGC-823、SGC-7901、MKN-28中的Caspase-3的活性，活化BGC-823細(xì)胞中Ca

8、spase-8的活性。
　　 DATS具有抑制人胃腫瘤細(xì)胞BGC-823細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的作用。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DATS大、小劑量組裸鼠移植瘤平均體積分別為1013．90±402．65mm3和1203．55±269．35 mm3與模型組2026．36±407．36mm3比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0．05。裸鼠體重沒有發(fā)生顯著性改變，在DATS劑量為5mg/kg和20 mg/kg時(shí)，其抑制率分別為12％和38％，對(duì)裸鼠的

9、生存狀態(tài)幾乎沒有影響。DATS大、小劑量組裸鼠移植瘤組織的Caspase-3和Caspase-8的活性均高于模型組。
　　 結(jié)論：
　　 DATS可以抑制人胃腫瘤細(xì)胞BGC-823、SGC-7901、MGC80-3、MKN-28增殖；當(dāng)DATS的濃度為60μmol/L時(shí)，可以明顯誘導(dǎo)胃腫瘤BGC-823、SGC-7901、MKN-28細(xì)胞凋亡；DATS可能通過使BGC-823細(xì)胞內(nèi)Caspase-8的活性增加，從而直接活